發(fā)布時間：2020-05-25 13:57

【摘要】：背景和目的： 牙周病治療的最終目標是重建因炎癥過程而破壞的牙周組織,恢復其結(jié)構和功能,即實現(xiàn)牙周組織的再生。但因牙周病喪失的牙周組織,其修復與重建的難度很大。多年來,人們一直在尋求能有效增加牙周新附著、促進牙周組織再生的治療方法,并已開展了牙周骨移植、引導牙周組織再生(GTR)技術等多方面的研究,取得了一定的進展,但在恢復牙周組織的生理結(jié)構和功能上還遠未達到所期望的目標。組織工程應用于牙周組織缺損修復為牙周病的治療開辟了一條新途徑。 組織工程學的主要研究重點在于以下三個方面：(1)種子細胞的來源；(2)生物載體支架材料的選擇；(3)有效的細胞因子。要進行系統(tǒng)的牙周組織工程研究,就必須首先對以上三個問題進行探討、研究和解決。其中,選擇合適的種子細胞和有效的細胞因子是非常重要的。 誘導性多功能干細胞(induced Pluripotent Stem cells, iPS細胞)來源于成體細胞,其獲得方法相對簡單穩(wěn)定.不需要使用生殖細胞或破壞早期胚胎.在技術上和倫理上都更有優(yōu)勢。iPS細胞具有與胚胎干細胞(Embryonic Stem Cells,ESC)相似的生物學特性并能在適當?shù)恼T導條件下分化為3個胚層的細胞,是具有全能分化能力的干細胞。此外,iPS細胞可由患者自身細胞誘導獲得,具有與患者自身相同的基因組成,不會引起機體的免疫排斥反應。這種種特性表明iPS細胞成為理想種子細胞的可能性。 以前很多研究顯示了釉基質(zhì)蛋白(enamel matrix derivates, EMD)在牙周再生中的作用。EMD能夠誘導無細胞外源性纖維牙骨質(zhì)的再生(acellular extrinsic fiber cementum, AEFC)°。無細胞性牙骨質(zhì)與牙本質(zhì)的結(jié)合較細胞性牙骨質(zhì)與牙本質(zhì)的結(jié)合更加牢固。Boyan等在實驗中發(fā)現(xiàn)EMD可能具有骨促進而不是骨誘導作用,但使用劑量應達到或超過一定的閾值。在牙周組織再生的過程中,EMD可能作為一種基質(zhì),形成與牙周組織發(fā)育時類似的微環(huán)境,通過促進成骨細胞的功能活動而有利于牙槽骨的再生。 本研究中,體外實驗研究iPS細胞的成骨分化和EMD對iPS細胞的誘導作用；體內(nèi)實驗,將iPS細胞和EMD共同用于牙周組織骨缺損的組織工程學修復,探討將其應用于牙周再生的可行性。 方法和材料： (1)使用基質(zhì)膠(Matrigel)包被培養(yǎng)皿,采用無滋養(yǎng)層的方法培養(yǎng)人的iPS細胞。RT-PCR檢測培養(yǎng)人iPS細胞中干細胞特異性基因Oct4和Nanog的表達。然后采用克隆懸浮的方法獲取擬胚體(embryoid body, EB)。 (2)收集懸浮培養(yǎng)形成的EB,移入0.1%明膠處理過的培養(yǎng)板中,貼壁,并分別在普通培養(yǎng)液、加了礦化誘導液的培養(yǎng)液和加了EMD的培養(yǎng)液中培養(yǎng),觀察不同的培養(yǎng)液對細胞的向成骨方向分化和體外礦化的影響。采用PCR和Real-time PCR檢測成骨相關因子和蛋白,包括Runx2, OC, BSP等的mRNA表達；分別檢測不同培養(yǎng)液中的細胞在培養(yǎng)后的第7,12,23,30天的堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)的活性,觀察不同培養(yǎng)液中細胞在不同時間點的ALP蛋白活性；將細胞在不同培養(yǎng)液中培養(yǎng)28天后,茜素紅染色觀察其在體外形成礦化結(jié)節(jié)的能力,并分析其礦化面積所占的百分比。 (3)取12.5天左右的孕鼠,原代培養(yǎng)小鼠胚胎成纖維細胞(mouse embryonic fibroblast, MEF),使用適量γ射線照射后用于制備滋養(yǎng)層。在MEF滋養(yǎng)層上培養(yǎng)小鼠的iPS細胞,使用懸滴法獲得EB. (4)在裸小鼠的下頜磨牙區(qū)制作牙周骨缺損,然后使用組織工程技術修復牙周缺損。實驗分為三組：單純材料組,材料+EMD組和材料+EMD+鼠iPS細胞組,術中所用的材料為羥基磷灰石／/絲復合支架材料。術后12和24天,Real-time PCR檢測三組標本其新生骨組織的成骨相關因子和蛋白Runx2, OC, BSP,Osx的mRNA表達；對標本進行Micro-ct檢測,立體觀察分析牙周缺損區(qū)硬組織的新生情況；組織學分析來觀察缺損處成骨,成牙骨質(zhì)以及牙周修復的狀況。 結(jié)果： (1)在顯微鏡下觀察,未分化的人iPS細胞呈集落樣生長,不典型的圓形或橢圓形,集落邊緣光滑清晰,有的集落邊緣可見有少量細胞分化。細胞呈團狀排列,胞核大,胞漿少,核漿比較高。克隆邊緣分化后的細胞呈梭形或多邊型,細胞核小,胞漿豐富。RT-PCR實驗結(jié)果顯示培養(yǎng)的人iPS細胞中有Oct4和Nanog的表達。鏡下可觀察到,形成的EB懸浮在培養(yǎng)液中,呈現(xiàn)為規(guī)則或不太規(guī)則的球形。中心較致密,邊緣透亮。 (2) RT-PCR結(jié)果顯示,細胞BSP的mRNA表達水平,EMD和普通培養(yǎng)液中相差不大,均低于礦化誘導液組,統(tǒng)計學上有極顯著性差異(P0.01)。第20天時,Runx2的mRNA表達水平,EMD組高于礦化誘導液組和普通培養(yǎng)液組,礦化誘導液組又高于普通培養(yǎng)液組,且有極顯著性差異(P0.01)。在培養(yǎng)的第30天,同樣的,EMD組仍然有最高水平的表達,且差距有統(tǒng)計學意義(P0.05)。在第20和30天時,OC的mRNA表達水平,EMD組均為最低,且與其他兩組相比,均有極顯著性差異(P0.01); ColI的mRNA表達水平,在礦化誘導液組中最高,且其差異有統(tǒng)計學意義,而其余兩組差別不大。茜素紅染礦化結(jié)節(jié)的結(jié)果也發(fā)現(xiàn),三組中,EMD實驗組生成的礦化結(jié)節(jié)也最少(P0.01)。ALP活性檢測發(fā)現(xiàn),在第23天左右,不同培養(yǎng)液中的細胞其ALP活性達到最大值,且EMD培養(yǎng)液中的細胞ALP活性低于另外兩組。 (3)體內(nèi)動物實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),在術后12天和24天,相較其它兩組而言,材料+EMD+鼠iPS細胞的動物組均有較高的OC, Osx和Runx2的mRNA基因表達(P0.01或者0.05)。組織學分析顯示,術后12天和24天,新生成骨的百分比,在材料+EMD對照組中與在單純材料組中的相似。在絲材料+EMD+iPS細胞實驗組中比在其他兩個組中都要高,且有顯著的統(tǒng)計學差異(p0.01)。Micro-CT結(jié)果分析顯示在相同層次上,EMD+iPS細胞移植組的標本比EMD組的新形成的硬組織中多。使用3-D軟件將組織缺損處從CT立體圖像中切出來,也可以明顯看出實驗組的硬組織密度要比對照組高的多,這些都提示了iPS細胞實驗組中更多硬組織的生成。HE染色也顯示,術后24天,移植了iPS細胞的動物組有更多的新生骨組織和新生牙骨質(zhì)。 結(jié)論： 體外細胞誘導實驗中,EMD能很強的促進RUNX2的mRNA表達,但是卻抑制了OC的表達和體外礦化。實驗結(jié)果表明EMD可能促進間充質(zhì)前體干細胞向成骨細胞方向分化,但卻抑制了其終末分化為成熟的成骨細胞和體外礦化。 體內(nèi)動物實驗中,移植了iPS細胞和EMD可促進動物新生牙骨質(zhì)和牙槽骨的生成,有利于牙周缺損的修復,提示iPS細胞作為牙周組織工程種子細胞的可能性。
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R781.4

【參考文獻】

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1 劉宏偉,歐龍,龐勁凡,袁志萍;自體骨髓基質(zhì)細胞用于牙周骨缺損移植的動物實驗研究[J];牙體牙髓牙周病學雜志;2000年03期

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本文編號：2680254