【摘要】：目的:口腔扁平苔蘚(OLP)是一種慢性炎癥性疾病,其病因和發(fā)病機(jī)制尚不清楚。IκB激酶α(Ikkα)調(diào)節(jié)的乳腺絲氨酸蛋白酶抑制劑(MASPIN)已被證明參與了慢性炎癥過(guò)程,但MASPIN對(duì)OLP慢性炎性反應(yīng)的作用尚不清楚。因此,本研究的目的是探討MASPIN在OLP中的表達(dá)及其在炎癥反應(yīng)中的作用。材料與方法:免疫組化染色和實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time PCR)分別檢測(cè)OLP及健康對(duì)照組中MASPIN、Ikkα的亞細(xì)胞定位和表達(dá)情況;酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)比較OLP及健康對(duì)照組中炎性細(xì)胞因子(TNF-α,IL-6)的水平。脂多糖(LPS)刺激人口腔角質(zhì)細(xì)胞(HOKs)部分模擬OLP炎性環(huán)境,使用CCK8和ELISA實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)LPS對(duì)HOKs的毒性作用和LPS刺激HOKs后炎性細(xì)胞因子(TNF-α,IL-6)的表達(dá)情況,進(jìn)而確定LPS刺激HOKs的最佳濃度;隨后將實(shí)驗(yàn)分為四組:分別是實(shí)驗(yàn)組(MASPIN plasmids、IKKαsiRNA),陰性對(duì)照組(MASPIN-plasmids NC、IKKα-siRNA NC),熒光對(duì)照組(MASPIN-pEX-1、IKKα-FAM NC)和LPS對(duì)照組(control),利用脂質(zhì)體法分別轉(zhuǎn)染MASPIN質(zhì)粒和IKKα小干擾RNA并檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率;轉(zhuǎn)染成功后,將實(shí)驗(yàn)分為三組:分別是實(shí)驗(yàn)組(MASPIN plasmids、IKKαsiRNA),LPS對(duì)照組(control),空白對(duì)照組(negative control),利用Real-time PCR和Western Blot、ELISA分別檢測(cè)MASPIN過(guò)表達(dá)、IKKα沉默后LPS刺激的HOKs中MASPIN、IKKα及炎性細(xì)胞因子的mRNA和蛋白表達(dá)。結(jié)果:免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)顯示MASPIN和IKKα主要定位于OLP組織上皮層的胞質(zhì)中,另外,同健康對(duì)照組相比,OLP組中MASPIN低表達(dá),而IKKα與炎性細(xì)胞因子(TNF-α,IL-6)高表達(dá),且差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。CCK8實(shí)驗(yàn)顯示5ug/ml和10ug/ml的LPS對(duì)HOKs無(wú)毒性作用,同時(shí),ELISA實(shí)驗(yàn)表明10μg/ml LPS刺激的HOKs中TNF-α和IL-6的蛋白表達(dá)量最高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),因此,本實(shí)驗(yàn)最終選擇10ug/ml的LPS作為刺激濃度;Real-time PCR實(shí)驗(yàn)表明MASPIN質(zhì)粒和IKKαsiRNA均成功轉(zhuǎn)染入HOKs中,且轉(zhuǎn)染效率分別為57%和87%;此外,同LPS對(duì)照組相比,MASPIN過(guò)表達(dá)組中IKKα和炎性細(xì)胞因子TNF-α,IL-6低表達(dá),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),這表明MASPIN過(guò)表達(dá)抑制了LPS刺激的HOKs中IKKα及TNF-α,IL-6的表達(dá);相反,同LPS對(duì)照組相比,IKKα沉默組中MASPIN表達(dá)升高,而TNF-α,IL-6表達(dá)下降,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),這表明IKKα沉默促進(jìn)了MASPIN的表達(dá),抑制TNF-α和IL-6分泌。結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)OLP組織中MASPIN低表達(dá),而IKKα和炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-6高表達(dá);過(guò)表達(dá)MASPIN或沉默IKKα可通過(guò)抑制炎性細(xì)胞因子TNF-α和IL-6的表達(dá)而緩解LPS引起的炎性反應(yīng),推測(cè)MASPIN及IKKα可能參與并影響了OLP的發(fā)生發(fā)展,提示MASPIN和IKKα可能為OLP的潛在治療靶點(diǎn)。
【圖文】：

１６入 MASPIN plasmids 6h 后 FAM-NC 組中暗場(chǎng)及明場(chǎng)熒光細(xì)胞數(shù)量；（b）Real-ti和 Western Blot（右）檢測(cè) MASPIN 過(guò)表達(dá)效率；（c）加入 IKKα siRNA6h 后 F及明場(chǎng)熒光細(xì)胞數(shù)量；（d）Real-time PCR（左）和 Western Blot（右）檢測(cè) IK效率；(* p < 0.05, ** p < 0.01 vs. Control 組)圖 4 MASPIN 過(guò)表達(dá)和 IKKα 沉默效率檢測(cè) MASPIN過(guò)表達(dá)抑制了HOKs中IKKα和炎性細(xì)胞因子的表達(dá)MASPIN質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功后24h加入LPS，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24h，收細(xì)胞總RNA進(jìn)行Real-time PCR實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)相關(guān)基因的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)結(jié)

eal-time PCR 檢測(cè) IKKα 沉默后 MASPIN、TNF-α 和 IL-6 的 mRNA 表達(dá)；（b）WesteKα 沉默后 IKKα 和 MASPIN 的蛋白表達(dá)；（c，，d）ELISA 檢測(cè) IKKα 沉默后 TNF-α（右）的蛋白表達(dá) (# p < 0.05, ## p < 0.01 vs Negative Control 組；* p < 0.05, ** p < Control 組)圖 6 IKKα 沉默促進(jìn) MASPIN 表達(dá)、抑制炎性細(xì)胞因子表達(dá)
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R781.5

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本文編號(hào)：2671015