【摘要】： 一、研究背景 掌跖角化牙周病變綜合征(Syndrome of keratosis palmoplantaris with Periodontopathia)，是一種罕見的常染色體隱性遺傳疾病(MIM 245000)，又稱帕-勒氏綜合征(Papillon-Lefèvre syndrome，PLS)。發(fā)病率約為1-4／百萬，臨床特征是在發(fā)病早期出現(xiàn)乳牙和恒牙的牙周組織破壞，手掌腳掌的皮膚過度角化，伴有牙周組織過早破壞的嚴(yán)重早發(fā)性牙周炎常導(dǎo)致患者乳牙和恒牙過早脫落，牙槽骨破壞致使患者通常在15歲時開始出現(xiàn)牙齒脫落，并在出生后一年內(nèi)就已經(jīng)表現(xiàn)出對細(xì)菌的易感性增加。常規(guī)的口腔治療包括口腔衛(wèi)生宣教、刮治和根面平整、阿莫西林-甲硝唑全身抗生素療法等對PLS患者的侵襲性牙周炎療效欠佳。 牙周病由牙齦炎和牙周炎兩種形式組成，臨床上牙齦炎是牙齒周圍軟組織的可逆性炎癥，牙周炎與身體其他系統(tǒng)的多種疾病相關(guān)，這些疾病可引起不可逆的牙周組織破壞(結(jié)合上皮、牙周韌帶、牙槽骨)，成人牙周病發(fā)生率為15-20％，兒童牙周病的發(fā)病率為0.5-3％，大多數(shù)牙周病的病因是復(fù)雜的多因素的，與環(huán)境和遺傳因素密切相關(guān)。雖然特異性細(xì)菌(革蘭氏陰性菌)與環(huán)境因素(例如吸煙)在牙周病的起病初期和發(fā)展過程中起重要作用，但是否會引起疾病發(fā)作則取決于宿主抵抗致病因素的先天反應(yīng)。目前為止，微生物和環(huán)境因素的特異性靶分子還不清楚，但牙周炎有明顯的遺傳基礎(chǔ)這點是逐漸明確的，目前已知大多數(shù)成人型牙周炎和早發(fā)性牙周炎(early onset periodontitis，EOP)均有遺傳傾向，與成人型牙周炎和早發(fā)性牙周炎相比PLS患者的遺傳基因突變是主要致病因素。 PLS主要由組織蛋白酶C(CTSC)的基因突變引起，CTSC基因編碼的組織蛋白酶C(cathepsin C)也被稱作二肽肽酶Ⅰ(dipeptidyl peptidaseⅠ，DPPI)是一種溶酶體半胱氨酸蛋白酶，是肽酶C1家族的成員，它具有肽鏈內(nèi)切酶的活性，是溶酶體內(nèi)一種重要的內(nèi)切蛋白酶，它的作用是從蛋白質(zhì)底物的氨基酸末端除去二肽，對免疫細(xì)胞和炎性細(xì)胞內(nèi)的許多蛋白質(zhì)降解和絲氨酸蛋白酶的活化有重要作用，例如：免疫系統(tǒng)的多核白細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞和他們的前體細(xì)胞。DPPI對免疫細(xì)胞和炎性細(xì)胞內(nèi)的許多絲氨酸蛋白酶的活化起主要的調(diào)節(jié)作用，在多種組織內(nèi)有較高水平的表達，例如肺、腎臟和其他的上皮組織。目前認(rèn)為DPPI的免疫作用主要是蛋白質(zhì)的降解和酶原的活化二者協(xié)同作用的結(jié)果。PLS的病因?qū)W在過去的幾年的研究中已經(jīng)有了很多進展，包括免疫變態(tài)反應(yīng)和對細(xì)菌感染的易感性，然而對皮膚病損和牙齦病變二者之間的關(guān)系仍然不清楚。最初PLS位點被定位在第11染色體的11q14 CTSC基因突變導(dǎo)致其編碼的蛋白質(zhì)異常，引起伴有牙周炎的掌跖角化癥，又稱掌跖角化牙周病變綜合征(PLS)，CTSC基因突變的雜合子攜帶者既沒有手掌腳掌過度角化表現(xiàn)也無侵襲性牙周炎，因此，一個野生型的CTSC基因的存在可以完全防止該疾病的發(fā)生，另外，在Haim-Munk syndrome和青春期前牙周炎患者也可檢測到CTSC基因的突變。 Toomes等在1999年的研究中通過功能測定發(fā)現(xiàn)PLS患者CTSC的活性幾乎全部喪失，而在CTSC基因突變攜帶者中其活性顯著降低，CTSC基因位點在染色體11q14基因圖譜的1.2cM間隔內(nèi)，這個間隔內(nèi)的物理和基因圖譜相關(guān)性顯示：此區(qū)域內(nèi)包含有幾個表達序列標(biāo)記(Expressed Sequence Tags，ESTs)和6個包括溶酶體蛋白酶組織蛋白酶C(CTSC)在內(nèi)的已知基因。據(jù)2006年07月21日最新數(shù)據(jù)顯示CTSC基因位于常染色體11q14.1-q14.3。 雖然目前的研究顯示CTSC基因突變導(dǎo)致其編碼的蛋白質(zhì)異常是引起PLS的主要原因，但PLS的病因?qū)W還有很多尚不清楚。據(jù)目前的研究顯示CTSC基因突變雜合子攜帶者并不出現(xiàn)手掌腳掌皮膚過度角化和侵襲性牙周炎的臨床表現(xiàn)，提示一個野生型的CTSC基因的存在可以防止PLS的發(fā)生。 CTSC全長約46kb，包含有7個外顯子和6個內(nèi)含子。其1.8kb長的mRNA編碼了一個463個氨基酸的多肽，此多肽可能由24個氨基酸單肽、206個氨基酸前肽和233個氨基酸成熟酶組成。到目前為止，在不同種族PLS患者中發(fā)現(xiàn)的CTSC基因突變形式多達50余種，在漢族家系有關(guān)CTSC基因突變的報道不多。 二、研究目的： 通過對PLS患者及其家人的CTSC基因序列的分析，探討掌跖角化牙周病變綜合征(Syndrome of keratosi s palmoplantaris with Periodontopathia)，又稱帕-勒氏綜合征，(Papillon-Lefèvre syndrome，PLS)患者組織蛋白酶C基因(CTSC)突變特點，進一步證實組織蛋白酶C基因的突變是PLSI臨床顯性的病因，為PLS的基因診斷提供了理論依據(jù)，CTSC新的突變類型擴大了CTSC基因的突變譜，對進一步研究CTSC基因在PLS發(fā)生中所起的作用提供了理論依據(jù)。 三、研究方法： 1、臨床病例和診斷 廣東省口腔醫(yī)院牙周病科治療的一例臨床診斷為PLS的20歲男性，患者的父母出生于廣東省，患者父母無血緣關(guān)系。患者在3歲時就出現(xiàn)侵襲性牙周炎和雙足底、手掌皮膚角化過度的臨床癥狀，同時伴有肘部膝部皮膚的過度角化。侵襲性牙周炎引起的乳牙脫落使患者在6歲時大部分乳牙都已經(jīng)缺失，乳牙脫落后牙周炎癥消退牙齦恢復(fù)正常。同時在兒童時期有反復(fù)發(fā)作的扁桃腺炎和發(fā)燒等臨床表現(xiàn)，患者的父母和其妹妹臨床檢查是正常的。 2、基因組DNA提取 在知情同意基礎(chǔ)上，分別抽取PLS患者及其父母的外周靜脈血，對照組DNA來源于20個無皮膚病變的正常人，用基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA(Tiangen Biotech Co. Ltd，Beijing，China天根生化科技北京有限公司)。用Chelex-100從患者妹妹的頰粘膜拭子中提取基因組DNA。以提取之DNA作為模板，用成對的外顯子特異性引物對患者的CTSC基因組DNA的全部7個外顯子進行PCR擴增反應(yīng)。引物序列的設(shè)計按照Toomes等在1999年文獻中報道的方案。 3、聚合酶鏈反應(yīng)和DNA直接測序 應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)和DNA直接測序方法對PLS患者CTSC基因的1—7外顯子的突變進行檢測。同時也分別檢測患者父母和妹妹的CTSC基因的1—7外顯子序列。PCR擴增反應(yīng)體系為50μl反應(yīng)體系，其中基因組DNA 50ng(50μg／ml)，每種引物各1μl(25μmol)，dNTP Mixture(各2.5mM)2μl，0.25μl的Ex-Taq酶(5U／μl)(TaKaRa ExTaq PCR kit,TaKaRa Biotechnology Dalian Co.,Ltd)，10×PCR Buffer 5μl，在PTC-100 Programmable Thermal Controller(MJ Research Inc.U.S.A)擴增儀上進行擴增反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5min，95℃變性20s，按各自的退火溫度退火20s，72℃延伸30s，進行32—35個循環(huán)，最后在72℃延伸4min。PCR產(chǎn)物直接測序，檢測到患者有幾個堿基改變。 四、結(jié)果： 病人3歲時就已經(jīng)有手掌腳掌過度角化和嚴(yán)重牙周炎的疾病發(fā)作史，同時伴有膝部肘部的皮膚過度角化。牙周組織早期破壞的侵襲性牙周炎導(dǎo)致的乳牙過早脫落后牙周炎癥消退。該PLS患者在6歲(1993年)時大部分乳牙已經(jīng)脫落，并在兒童時期就表現(xiàn)出對細(xì)菌感染的易感性增加，反復(fù)發(fā)作的感染，特別是反復(fù)發(fā)燒、扁桃腺發(fā)炎。患者的父母和妹妹均未發(fā)病。 通過對一個PLS患者的CTSC基因分析已確定了4個新的突變，對患者CTSC基因外顯子1-7的PCR產(chǎn)物直接測序分析，在外顯子1的116位堿基G被刪除了(c.116delG)導(dǎo)致其后的第40位氨基酸到第50位氨基酸發(fā)生了移碼突變，患者父母和妹妹此區(qū)域的DNA序列是正常的；患者外顯子6在763位的堿基T被A置換(c.763T＞A)，產(chǎn)生了一個單堿基雜合突變，此突變導(dǎo)致CTSC基因第255位氨基酸密碼子由TGT替換為AGT，其編碼的氨基酸由C半胱氨酸替換為S絲氨酸(p.C255S)；外顯子7的第941位堿基T被C置換(c.941T＞C)，導(dǎo)致CTSC基因第314位氨基酸密碼子由TTT替換為TCT，其編碼的氨基酸由F苯丙氨酸變?yōu)镾絲氨酸(p.F314S)。外顯子7的第1005位堿基A被G置換，(c.1005A＞G)，導(dǎo)致CTSC基因第335位氨基酸密碼子由GAA替換為GAG(p.E335E)，但其編碼的氨基酸未改變，仍為E谷氨酸，此突變?yōu)橥x突變。 五、結(jié)論： 通過對一個漢族家庭的PLS患者的CTSC突變基因的分析已確定了4個新的突變，證實掌跖角化牙周病變綜合征或帕-勒氏綜合征(Papillon-Lefèvre syndrome，PLS)與CTSC基因的突變有關(guān)，但突變的類型和病變的嚴(yán)重程度及皮膚病變發(fā)生的部位之間的關(guān)系還不明確。PLS是一種伴有掌跖過度角化(palmoplantar hyperkeratosis，PPKs)和嚴(yán)重牙周破壞為臨床特征的掌跖角化病(palmoplantar keratoderma，PPK)，PPKs是全部掌跖皮膚增厚的不同種類的一組疾病。臨床上區(qū)別PLS和其他的PPK是嚴(yán)重的早期發(fā)作的牙周破壞�；颊呷檠赖陌l(fā)育和萌出過程是正常的，但是牙齒萌出進入口腔內(nèi)就與牙齦感染和后來發(fā)生的快速牙周破壞有關(guān)，這些破壞性牙周病的形式特點是對傳統(tǒng)的牙周治療不敏感，因此，通常乳牙過早脫落，脫落后炎癥消退牙齦恢復(fù)健康外觀。而在恒牙萌出時期此過程重復(fù)出現(xiàn)，導(dǎo)致恒牙過早脫落，多數(shù)患者雖然第三磨牙保留下來了，但PLS患者牙槽骨有嚴(yán)重吸收，導(dǎo)致牙槽嵴廣泛萎縮，牙齒治療更復(fù)雜。有報告顯示，通過牙周非手術(shù)治療，結(jié)合抗生素的全身使用，拔除嚴(yán)重的患牙和認(rèn)真的維護治療，對某些掌跖角化—牙周破壞綜合征患者有一定的療效。但至今無一例報告掌跖角化—牙周破壞綜合征患者經(jīng)過治療恒牙全部保留。 我們檢測了一個PLS患者及其家庭成員的CTSC基因，并對該基因的突變進行了評估。用多聚酶鏈反應(yīng)擴增PLS患者CTSC基因的全部7個外顯子，擴增后的產(chǎn)物直接進行測序。檢測到在CTSC基因第314氨基酸有一個錯義突變，此處的氨基酸由F苯丙氨酸變?yōu)镾絲氨酸(p. F314S)，此突變改變了組織蛋白酶C多肽該區(qū)域的高度保守氨基酸位點，，使CTSC蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變。在第255位氨基酸有一個雜合的錯義突變，此處的氨基酸由C半胱氨酸替換為S絲氨酸(p.C255S)，也影響了組織蛋白酶C多肽的高保守氨基酸位點，使CTSC蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變。在116堿基處有一個刪除堿基G的突變，和一個335氨基酸的同義突變。同時在正常對照組中也未檢測到這些突變。以前報導(dǎo)過突變的雜合子攜帶者沒有PLS的臨床表現(xiàn)和癥狀，此PLS患者是一個CTSC基因的復(fù)合型雜合突變。這些組織蛋白酶C基因的突變，擴大了PLS的突變譜，有助于理解基因型和顯性之間的關(guān)系。 本研究的一例掌跖角化牙周病變綜合征患者，經(jīng)過廣東省口腔醫(yī)院牙周病科12年的治療和觀察，所有恒牙完好保留，所采取的治療措施包括牙周非手術(shù)治療，抗生素的全身使用，認(rèn)真的維護治療，以及非激素類抗炎藥和補腎固齒中藥的應(yīng)用。該病例的成功治愈的機制與組織蛋白酶C基因突變之間的關(guān)系還有待進一步的探討。
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圖2.13.5歲時曲面斷層片，顯示乳牙牙梢骨嚴(yán)重吸收Fig2.1PanograPliicradiograPhOf3·5yearsoldshowingseverealveolarbone1055arothePrimaryteeth公圖2.2患者5.5歲時手掌)“‘泛的過角化情況Fig2.2DII]抽sehyperkeratosisa到Feetingthehandsatsjycarsofage.

圖2.2患者5.5歲時手掌)“‘泛的過角化情況g2.2DII]抽sehyperkeratosisa到Feetingthehandsatsjycarsofage圖2.3患者5.5歲時腳掌廠‘泛的過角化情況Fig2.3Di徹sehyperkeratosisaffeetingthefeetat5.5yearsofage
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：R781.4;R596

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1 李曉峰;一個掌跖角化牙周病變綜合征患者家系組織蛋白酶C基因突變分析[D];南方醫(yī)科大學(xué);2007年

本文編號：2667902