【摘要】： 牙齒的發(fā)育是一個長期、復雜的生物學過程,包括上皮間充質(zhì)相互作用、細胞分化、形態(tài)發(fā)生、組織礦化和萌出,在這一過程中有眾多生物因子參與并互相協(xié)調(diào)構成調(diào)控牙齒發(fā)育的信號網(wǎng)絡。 氯離子通道是生物體內(nèi)一種重要的陰離子通道,它們在細胞膜和胞內(nèi)細胞器質(zhì)膜的跨膜轉(zhuǎn)運中起著特定的生物學功能。最新的實驗證據(jù)顯示,牙齒組織中有氯離子通道存在,某些氯離子通道基因敲除小鼠模型(CFTR和ClC-5)出現(xiàn)了明顯的牙齒結構和形態(tài)異常。ClC-7是電壓門控氯離子通道家族的一個成員,在體內(nèi)廣泛存在。研究表明ClC-7與某些骨遺傳性疾病密切相關,人們在研究Clcn7-/-小鼠的過程中發(fā)現(xiàn),Clcn7-/-小鼠表現(xiàn)出嚴重的視網(wǎng)膜變性和骨硬化癥等癥狀,并伴有牙齒不萌出的現(xiàn)象,同時在嬰兒骨硬化患者中也發(fā)現(xiàn)了CLCN7基因的突變型。結合氯離子通道特別是ClC-7的生理功能和牙胚發(fā)育的自身特點,以及牙齒和骨在組織結構上具有的相似性,我們提出這樣的假設:ClC-7可能參與了牙齒的發(fā)育過程。 本課題采用免疫組織學、原位雜交、RT-PCR和細胞培養(yǎng)等技術進行了以下三個部分的實驗研究: 第一部分ClC-7在小鼠牙胚中的表達研究 本部分首先應用RT-PCR方法證實出生1d的小鼠牙胚中有Clcn7的表達,然后應用免疫熒光技術來確定小鼠牙胚中ClC-7蛋白表達分布模式和原位雜交的方法觀察Clcn7 mRNA在小鼠牙胚中的表達。ClC-7蛋白和Clcn7 mRNA在小鼠鐘狀期牙胚中廣泛表達。小鼠磨牙牙胚鐘狀早期,內(nèi)釉上皮層細胞、中間層細胞、星網(wǎng)狀層細胞、牙乳頭細胞都有ClC-7陽性表達,內(nèi)釉上皮層呈強陽性表達;小鼠磨牙牙胚鐘狀晚期,ClC-7蛋白和Clcn7 mRNA在成釉細胞、成牙本質(zhì)細胞中存在陽性表達,同時在牙乳頭細胞、星網(wǎng)狀層細胞也呈陽性表達。這些實驗結果說明電壓門控氯離子通道ClC-7可能在牙齒發(fā)育過程中具有一定的調(diào)控作用,可能參與了成牙本質(zhì)細胞、成釉細胞的生理過程。 第二部分ClC-7在牙齒相關細胞中的表達研究 本部分實驗采用RT-PCR和免疫組織化學方法檢測了Clcn7 mRNA和ClC-7蛋白在體外培養(yǎng)的成釉細胞樣細胞LS8、成牙本質(zhì)細胞樣細胞MDPC-23中的表達情況。結果表明,成釉細胞樣細胞LS8、成牙本質(zhì)細胞樣細胞MDPC-23中都有Clcn7 mRNA和ClC-7蛋白的表達,兩種細胞中Clcn7 mRNA表達水平?jīng)]有顯著差異,但成牙本質(zhì)細胞樣細胞MDPC-23中ClC-7蛋白表達水平要高于成釉細胞樣細胞ClC-7蛋白表達水平。本部分結果揭示,成釉細胞樣細胞LS8、成牙本質(zhì)細胞樣細胞MDPC-23可以做為進一步研究ClC-7參與牙齒發(fā)育調(diào)控機制的細胞模型,為今后研究ClC-7在成釉細胞、成牙本質(zhì)細胞中的生理作用提供了實驗基礎。 第三部分ClC-7在牙乳頭細胞分化中的作用研究 本部分采用原代細胞培養(yǎng)技術,體外培養(yǎng)小鼠牙乳頭細胞,分為實驗組和對照組,實驗組同時加入終濃度為25ng/ml的M-CSF和終濃度為50ng/ml的RANKL誘導48h,對照組不加任何誘導因子,然后采用免疫熒光染色、原位雜交和RT-PCR的方法對實驗組和對照組中ClC-7蛋白和Clcn7 mRNA表達進行比較。實驗結果表明,加入誘導因子M-CSF和RANKL的牙乳頭細胞中ClC-7蛋白和Clcn7 mRNA表達均高于對照組。本部分研究表明,M-CSF和RANKL可以提高ClC-7在牙乳頭細胞中的表達水平,可能促進了牙乳頭細胞的分化,但M-CSF和RANKL促進牙乳頭細胞中ClC-7蛋白和Clcn7 mRNA水平升高的機制和途徑有待于進一步研究,提示ClC-7可能參與了牙乳頭的分化。 綜合以上實驗結果,ClC-7在小鼠牙胚中有特異性空間表達,并且在體外培養(yǎng)的成釉細胞樣細胞LS8、成牙本質(zhì)細胞樣細胞MDPC-23也有表達,ClC-7可能參與了牙齒的發(fā)育過程;經(jīng)M-CSF和RANKL誘導的牙乳頭細胞ClC-7表達水平升高,揭示ClC-7可能與牙乳頭細胞的分化相關。
【圖文】：

-/-小鼠骨骼系統(tǒng)異常，，是由于其體內(nèi)破骨細胞功能喪失，導致骨圖1 正常小鼠和Clcn7-/-小鼠體形 圖2 正常小鼠和Clcn7-/-小鼠骨骼X線片圖3 正常小鼠和Clcn7-/-小鼠的脛骨X線片 圖4 正常小鼠和Clcn7-/-小鼠的脛骨切片-16-

圖1 正常小鼠和Clcn7-/-小鼠體形 圖2 正常小鼠和Clcn7-/-小鼠骨骼X線片圖3 正常小鼠和Clcn7-/-小鼠的脛骨X線片 圖4 正常小鼠和Clcn7-/-小鼠的脛骨切片-16-
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2008
【分類號】：R78

【參考文獻】

相關期刊論文 前1條

1 趙征;金巖;文玲英;;ADAM28在小鼠牙胚發(fā)育中的時空表達[J];實用口腔醫(yī)學雜志;2006年05期

本文編號：2664502