【摘要】：目的：健康人來(lái)源的牙周膜干細(xì)胞(periodontal ligament stem cells, PDLSCs)是牙周組織中的成體干細(xì)胞,具有自我更新能力和多項(xiàng)分化潛能,國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)篩選的牙周膜干細(xì)胞可分別形成骨樣結(jié)構(gòu)(體外誘導(dǎo))和成牙本質(zhì)樣結(jié)構(gòu)(動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn))。但是2型糖尿病伴牙周炎狀態(tài)下的PDLSC自我更新能力和多項(xiàng)分化能力的研究并未見(jiàn)報(bào)道,本實(shí)驗(yàn)擬從基因、蛋白水平觀察2型糖尿病患者PLDSCs多項(xiàng)分化能力。通過(guò)體外擴(kuò)增培養(yǎng)正常人、牙周炎患者和2型糖尿病伴牙周炎患者牙周膜成纖維細(xì)胞,經(jīng)過(guò)篩選和鑒定PDLSC,比較體外培養(yǎng)的正常人牙周膜干細(xì)胞(H-PDLSC)、牙周炎患者牙周膜干細(xì)胞(P-PDLSC)和糖尿病伴牙周炎患者牙周膜干細(xì)胞(D-PDLSC)自我更新和成骨成脂分化的能力,進(jìn)而從PDLSC的功能變化解釋2型糖尿病患者牙周炎患病率高的臨床現(xiàn)象。 方法：本實(shí)驗(yàn)采用體外組織塊法體外培養(yǎng)正常人、牙周炎患者和2型糖尿病伴牙周炎患者前磨牙或第三磨牙牙周膜成纖維細(xì)胞,通過(guò)有限稀釋法分別篩選PDLSCs,即原代細(xì)胞低密度接種后待克隆細(xì)胞增殖到孔底80%后胰酶消化并常規(guī)培養(yǎng),通過(guò)計(jì)算克隆形成率、免疫熒光細(xì)胞化學(xué)、流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表型分子對(duì)PDLSCs進(jìn)行初步干細(xì)胞鑒定；MTT法、流式細(xì)胞周期檢測(cè)比較H-PDLSC、P-PDLSC和D-PDLSC增值能力；利用成骨、成脂誘導(dǎo)液分別對(duì)三組干細(xì)胞進(jìn)行成骨、成脂誘導(dǎo)21天,茜素紅、油紅O染色觀察鈣化結(jié)節(jié)、脂滴形成情況；連續(xù)9天觀察三組干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)期間ALP活性；實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(real time PCR, RT-PCR)檢測(cè)誘導(dǎo)7天后的成骨基因(ALP、RUNX-2、BSP、OCN、Col-1)和成脂基因(LPL、PPAR)表達(dá),同時(shí)利用Western Blot技術(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證RT-PCR結(jié)果。 結(jié)果：(1)干細(xì)胞的分離與初步鑒定：成功培養(yǎng)H-PDLSC 10例,P-PDLSC 7例,D-PDLSC 3例,有限稀釋法篩選的PDLSCs細(xì)胞形態(tài)并無(wú)明顯差異,均呈長(zhǎng)梭形、胞體豐滿(mǎn)的成纖維樣細(xì)胞；免疫熒光細(xì)胞檢測(cè)發(fā)現(xiàn),三組干細(xì)胞波形絲蛋白均陽(yáng)性表達(dá),細(xì)胞角蛋白陰性表達(dá)；同時(shí)標(biāo)記細(xì)胞表型分子CD146和STRO-1,經(jīng)Image-Pro Plus軟件分析D-PDLSC表型分子CD146和STRO-1陽(yáng)性細(xì)胞量表達(dá)較P-PDLSC和H-PDLSC低(P0.05),STRO-1陽(yáng)性細(xì)胞百分比分別為：62.6±1.6%(H-PLDSC)、40.6±2.5%(P-PDLSC)和27.2±1.6%(D-PDLSC),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；CD146陽(yáng)性細(xì)胞百分比分別為：69.6±3.4%(H-PLDSC)、48.9±1.6%(P-PDLSC)和32.1±0.9 %(D-PDLSC),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),同時(shí)經(jīng)流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)CD14、CD34、CD29、CD90和STRO-1等表型分子進(jìn)一步確認(rèn)了干細(xì)胞的來(lái)源及其干細(xì)胞特性。 (2)干細(xì)胞自我更新和增值能力比較：H-PDLSC、P-PDLSC和D-PDLSC具有一定的自我更新能力,克隆形成率分別為：36.8±4.9%、25.0±2.3%和17.8±2.1%, D-PDLSC克隆形成率較P-PDLSC(P0.05)和H-PDLSC均低(P0.001),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；MTT法連續(xù)七天對(duì)三種細(xì)胞增值情況比較得出,相同培養(yǎng)條件下,D-PDLSC增值能力較P-PDLSC和H-PDLSC均弱,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01),同時(shí)通過(guò)對(duì)三種細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞周期檢測(cè),發(fā)現(xiàn)D-PDLSC的S+M期和G2/G1期細(xì)胞數(shù)量較少,進(jìn)一步證實(shí)了D-PDLSC細(xì)胞增殖能力較P-PDLSC和H-PDLSC弱。 (3)成骨成脂分化誘導(dǎo)能力比較：成骨成脂誘導(dǎo)液分別對(duì)三組干細(xì)胞誘導(dǎo)21天,經(jīng)Image-Pro Plus軟件分析,發(fā)現(xiàn)相同視野下,H-PDLSC誘導(dǎo)后鈣化結(jié)節(jié)和脂滴面積形成最多,P-PDLSC次之,D-PDLSC最少；另外,通過(guò)RT-PCR檢測(cè)誘導(dǎo)一周后的RUNX-2、ALP、BSP、OCN和Col-1成骨基因和PPAR y.LPL成脂基因,發(fā)現(xiàn)D-PDLSC成骨、成脂相關(guān)基因的表達(dá)均低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。同時(shí)Western Blot技術(shù)驗(yàn)證了RT-PCR結(jié)果。 (4) H-PDLSC、P-PDLSC和D-PDLSC炎性因子檢測(cè)：誘導(dǎo)前通過(guò)RT-PCR技術(shù)比較三組干細(xì)胞炎性因子IL-6和TNF-α表達(dá)情況。結(jié)果顯示,與H-PDLSC比較,D-PDLSC IL-6和TNF-α表達(dá)最高,P-PDLSC次之,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)首次從糖尿病伴牙周炎患者中成功提取牙周膜干細(xì)胞,并且通過(guò)干細(xì)胞鑒定,雖然與H-PDLSC和P-PDLSC比,D-PDLSC細(xì)胞形態(tài)并無(wú)明顯的差別,但在特異性干細(xì)胞表型分子表達(dá)和干細(xì)胞的自我更新方面,同時(shí)也證明了,D-PDLSC與H-PDLSC—樣,具有干細(xì)胞特性；通過(guò)對(duì)三種干細(xì)胞成骨、成脂方向誘導(dǎo)結(jié)果分析,可以從干細(xì)胞的角度可以初步解釋臨床上2型糖尿病患者牙周病患病率高、病變嚴(yán)重的原因：可能是2型糖尿病狀態(tài)通過(guò)降低牙周膜干細(xì)胞的自我更新和分化能力,從而加速了牙周組織的破壞,特別是阻礙或抑制牙周膜新附著的形成和牙周膜干細(xì)胞向牙槽骨分化,導(dǎo)致牙周袋的形成。
【圖文】：

波形絲蛋自(A，，H一pDLSC;B，p一PDLSC:C，D一PDLSe鄧11性表達(dá)、角蛋白(D，H一poLsC;E，P一PoL5e;F，D一PoLse)卜{I性表達(dá)(免疫細(xì)胞熒光x一00倍)

一PDLsc、P一POLSc和D一PDLsc自我更新能力比較
【學(xué)位授予單位】：遵義醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類(lèi)號(hào)】：R587.1;R781.4

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 倪靈;限制性應(yīng)激與糖尿病對(duì)大鼠牙周炎形成的影響的實(shí)驗(yàn)研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2012年

本文編號(hào)：2655309