【摘要】：牙骨質是貼附在牙根表面的薄層礦化組織,是牙周組織的重要組成部分,也是正畸治療牙齒移動的基礎。在牙根發(fā)育完成后牙骨質通常不再發(fā)生生理性改建,缺乏與骨組織類似的重塑能力。在正畸治療導致牙骨質吸收后,牙骨質的修復依靠成牙骨質細胞完成,伴隨成牙骨質細胞增殖、分化及礦化,逐漸形成修復性牙骨質。因此研究如何提高成牙骨質細胞的功能對于牙骨質修復十分重要,也為防治正畸性牙根吸收和牙周組織修復提供理論基礎。IL1β是感染早期最常見的細胞因子之一,可調節(jié)免疫反應介導的炎癥作用,在正畸患者和牙周炎患者的牙周組織中高表達,有誘導炎癥損傷、促進骨吸收和抑制成骨細胞分化的作用。但是,IL1β在牙骨質代謝中的作用,尤其是對成牙骨質細胞的作用機制研究較少,我們進行以下實驗旨在探討IL1β對成牙骨質細胞分化的作用及機制,為炎癥性牙骨質喪失疾病的防治提供理論基礎。1.IL1β對成牙骨質細胞的作用目的:探討IL1β對成牙骨質細胞增殖、分化及礦化作用。方法:培養(yǎng)成牙骨質細胞系OCCM-30,使用IL1β重組蛋白(10 ng/mL)處理成牙骨質細胞并對其進行成牙骨質礦化誘導。MTT法檢測IL1β對成牙骨質細胞增殖的影響;流式細胞術觀察IL1β對成牙骨質細胞凋亡的影響;real-time PCR及Western blot法測定成牙骨質分化相關基因runx2和osterix的表達水平;微板法定量和染色法定性檢測成牙骨質細胞的堿性磷酸酶活性;茜素紅染色及相對定量分析礦化結節(jié)形成量。結果:IL1β對成牙骨質細胞的增殖及凋亡無影響;下調runx2和osterix的表達水平,降低堿性磷酸酶活性及礦化結節(jié)形成能力。結論:IL1β對成牙骨質細胞的分化有抑制作用。2.MiR-325-3p在IL1β抑制的成牙骨質細胞分化中的調控作用目的:在microRNA參與的轉錄后基因表達調控水平上,探討IL1β抑制成牙骨質細胞分化的作用機制。方法:利用生物信息學分析技術及real-time PCR實驗篩選出miR-325-3p,應用雙熒光素酶及免疫熒光實驗驗證其靶基因。在加入IL1β刺激的同時瞬時轉染miR-325-3p,檢測成牙骨質細胞分化相關基因runx2和osterix的表達水平。同時,建立小鼠異位成骨模型,對移植物進行micro-CT、堿性磷酸酶活性及鈣離子含量檢測。結果:IL1β上調miR-325-3p的表達,且miR-325-3p直接靶向runx2。轉染miR-325-3p mimic可下調成牙骨質細胞runx2和osterix的表達水平,在異位成骨實驗中可顯著降低新形成的牙骨質樣組織的骨密度、骨體積分數(shù)、堿性磷酸酶活性及鈣離子含量;而轉染miR-325-3p inhibitor得到的結果與mimic完全相反。在加入IL1β刺激的炎癥狀態(tài)下,成牙骨質分化相關基因表達及體內成牙骨質能力顯著降低;并且在轉染miR-325-3p inhibitor后IL1β的作用被減弱。結論:IL1β通過上調miR-325-3p的表達,直接作用于靶基因runx2,進而抑制成牙骨質細胞分化;轉染miR-325-3p inhibitor可減弱IL1β對成牙骨質細胞分化的抑制作用。3.轉錄組測序分析IL1β對牙骨質細胞分化的作用機制目的:在轉錄水平上更全面地探討IL1β抑制成牙骨質細胞分化的作用機制。方法:對IL1β處理與非處理組的成牙骨質細胞生物樣本進行轉錄組二代測序分析。首先,收集細胞樣本,提取樣本RNA,構建RNA-seq文庫;其次,對文庫測序并對測序數(shù)據(jù)進行質量檢測、數(shù)據(jù)過濾及統(tǒng)計;然后,對測序數(shù)據(jù)進行差異表達分析、GO和KEGG生物信息學分析。結果:成牙骨質細胞生物樣本文庫構建成功;測序樣本達到高質量讀段控制標準;共得到112個顯著差異基因,包括85個上調基因和27個下調基因;GO富集分析揭示了整個作用過程中有1735個GO功能條目被顯著富集(p0.05),在免疫應答反應、對細胞外刺激反應等條目中顯示富集較高;KEGG富集分析顯示共有12個通路被顯著富集(p0.05),其中TNF信號通路、細胞因子與受體相互作用途徑、趨化因子信號通路、PI3K-Akt信號通路、Toll樣受體信號通路、JakSTAT信號通路為最主要的富集通路。結論:IL1β可刺激成牙骨質細胞產生免疫應答等多種生物學反應,可能通過TNF、PI3K-Akt等信號通路途徑發(fā)揮作用,為探討IL1β抑制成牙骨質細胞分化的作用機制提供有價值的新線索。4.Lcn2對成牙骨質細胞分化的作用目的:Lcn2作為測序得到的差異最顯著且表達豐度較高的“關鍵”基因,其在成牙骨質代謝調控中的作用亟待研究,本部分實驗旨在探討lcn2在調節(jié)成牙骨質細胞分化中的作用。方法:構建lcn2過表達質粒載體和沉默lcn2的siRNA,使用瞬時轉染法建立成牙骨質細胞過表達和敲減體系;流式細胞技術檢測轉染效率;real-time PCR和Western blot法檢測lcn2過表達和敲減的效果,以及對分化相關基因runx2、osterix等基因和蛋白表達情況的影響。結果:成功構建lcn2過表達質粒及沉默siRNA,瞬時轉染效率較高。在mRNA水平上過表達lcn2顯著高于對照組約25倍,敲減后約為對照組的一半;在蛋白水平上過表達lcn2表達增加約一倍,敲減后約為對照組的一半。Lcn2對成牙骨質細胞分化相關基因runx2、osterix、alp和ocn mRNA表達起負調控作用,對opn mRNA表達起正調控作用,對runx2和osterix的蛋白表達具有負調控作用。結論:Lcn2對成牙骨質細胞的分化有抑制作用。綜上所述,IL1β對成牙骨質細胞分化有抑制作用,其機制可能是在microRNA參與的轉錄后基因表達調控層面,通過激活miR-325-3p進而抑制下游轉錄因子runx2的表達,完成抑制成牙骨質細胞分化的過程;也可能是在轉錄水平的調控,測序篩選出的關鍵蛋白lcn2的表達被激活,進而抑制成牙骨質細胞的分化;轉錄組測序結果為以后的研究提供線索,有待于進一步挖掘。
【圖文】：

圖 1.1 巨噬細胞對牙根吸收過程影響示意圖（引自 A. Iglesias-Linares 等[15]）牙周膜與類牙骨質層作為牙周的保護組織，參與了抵抗牙根吸收的過程，主要表現(xiàn)在以下兩個方面：（1）類牙骨質層位于牙骨質的外層，是一層未完全礦化的薄層組織，破牙骨質細胞對牙骨質產生骨吸收作用時須先穿過類牙骨質層，相比于牙骨質層類牙骨質層富含有機成分，具有更強的物理抵抗作用，為保護牙根吸收提供第一道屏障[20]。（2）牙周膜與牙骨質間的細胞層，包含成牙骨質細胞、成骨細胞、成纖維細胞等，內環(huán)境因素改變激活其增殖、分化和礦化的能力，形成修復性牙骨質，對牙根吸收形成的牙骨質陷窩進行修復[21]。由此可知，正畸治療常引起牙骨質破壞，導致正畸炎性牙根吸收，誘導牙骨質再生是抵抗和修復牙根吸收的主要方法。1.2 牙骨質再生是牙根外吸收修復的關鍵牙骨質是牙周組織的重要組成部分，位于牙周膜與牙根之間，是貼附于牙根

在顯微鏡下觀察結果如圖2.1 所示，細胞傳代后約 4 h 即可貼壁，由漂浮的圓形細胞變成扁平貼壁的多角型細胞，細胞核位于胞漿中央，多為單核，，高倍鏡下可見核仁。當細胞密度較低時，細胞體積相對較大胞漿多，可見兩個以上較長突起，相鄰細胞的突起可連接在一起；當細胞密度較大時，細胞間基本無空隙，細胞體積隨胞漿減少而變小，細胞壓縮為長梭形，可由單層生長成為復層細胞。xs
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R78

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本文編號：2632335