【摘要】：牙釉質(zhì)是哺乳動物體內(nèi)最硬的組織，其確切的生物礦化機制目前尚不清楚。而釉原蛋白(Amelogenin，Am)是由成釉細胞合成和分泌的細胞外釉基質(zhì)蛋白，它在釉質(zhì)的生物礦化過程中起著啟動(牙釉質(zhì)的礦化)、調(diào)節(jié)(羥基磷灰石晶體的大小)、控制(晶體生長速度)和支架的關(guān)鍵性作用。Am的基因克隆是近年來國際上研究的一個熱門課題，但在對大鼠和人牙的研究中采用成年大鼠切牙和歐洲人牙cDNA庫為對象。而釉原蛋白的cDNA由于交叉剪切和酶的作用，不同國家的人其cDNA序列并不一致，所以研究中國人釉原蛋白cDNA序列意義重大；同時本課題取材于正在發(fā)育中的新生大鼠與中國人胚胎牙胚組織，采用與組織切片對照的方法，應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)，對大鼠與中國人Am的基因進行了克隆，原核表達和純化，制備了抗釉原蛋白抗體，標記了基因探針，進行了蛋白印記(Westernblot)、免疫組化和原位雜交的研究，并對釉原蛋白的一些相關(guān)功能作了初步的研究。從分子水平和蛋白水平探討了釉原蛋白的組織表達特異性，為進一步研究釉質(zhì)的生物礦化機理與功能和今后的臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。 一、純系Wistar大鼠與中國人牙釉原蛋白cDNA的克隆和序列分析 采用異硫氰酸胍一步法從新生純系Wistar大鼠、五月齡女性胎兒牙胚組織中抽提總RNA，用特異性O(shè)ligo (dt)作引物逆轉(zhuǎn)錄合成牙胚cDNA；分別設(shè)計一對引物進行PCR，擴增出大鼠和中國人的Am cDNA基因片段；將擴增的基因片段插入pBluescript KS (pBS)質(zhì)粒載體，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JM109，挑選陽性克隆并鑒定，用PE317-A型自動測序儀進行
【圖文】：

A260A/280=2.0/1.9�？俁NA的濃度為1.753/1.579(pg/pl);所提的總RNA濃度和純度都較標準�？俁NA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示285帶亮度約為185帶的2倍，，表明所獲得的RNA無明顯降解(圖1.1)。圖1.1牙胚組織總RNA瓊脂糖凝膠電泳(l%)右:大鼠左:人

圖1.21.0%瓊脂糖凝膠電泳(Ra)t1、3:PCR產(chǎn)物，2:入DN戶JEcoRI+HindlllMarkers圖1.31.0%瓊脂糖凝膠電泳(Human)一:一00bPMarker:2.PCR產(chǎn)物
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2000
【分類號】：R78

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本文編號：2626340