【摘要】： 目前,牙周疾病引起的牙周組織缺損的治療主要包括引導組織再生以及應用組織工程方法通過修復獲得牙周新附著,恢復天然牙周組織的解剖結(jié)構(gòu)和支持組織。 組織工程的基本方法是將體外培養(yǎng)擴增的正常組織細胞種植于天然的或人工合成的、具有良好的生物相容性和生物降解性的細胞外基質(zhì)材料上,經(jīng)過一段時間的培養(yǎng),將這種細胞生物材料復合體植入機體,以形成新的具有其原來特殊功能和形態(tài)的相應組織和器官,達到修復創(chuàng)傷和重建功能的目的。有研究報道[1],以牙周膜細胞為種子細胞,利用組織工程方法成功修復牙周組織。 研究表明體外培養(yǎng)的牙囊細胞在一定的誘導條件作用下可以向成骨/成牙骨質(zhì)細胞的表型分化[2]。那么以牙囊細胞為種子細胞是否可以修復牙周組織缺損呢?聯(lián)合應用BMP-2和地塞米松是否能促進牙囊細胞體內(nèi)成骨作用呢?目前尚無報道。 本實驗首先觀察了BMP-2、地塞米松以及二者聯(lián)合作用對大鼠牙囊細胞體外增殖和分化能力的影響。將不同誘導條件下的牙囊細胞與β-磷酸三鈣進行體外復合,觀察了細胞在支架材料表面的增殖與貼附情況,并將其植入免疫缺陷小鼠體內(nèi),觀察BMP-2和地塞米松聯(lián)合作用是否能夠增強牙囊細胞在體內(nèi)向成骨/成牙骨質(zhì)細胞的分化能力。本研究的內(nèi)容如下: 第一部分:大鼠牙囊細胞的體外培養(yǎng)及其鑒定 目的:體外培養(yǎng)大鼠牙囊細胞(RDFCs),鑒定其細胞來源及表型,為牙周組織再生的研究提供可靠的種子細胞來源。方法:選擇出生后6-7d SD仔鼠,分離上、下頜第一、第二磨牙牙胚,取牙囊組織進行原代和傳代培養(yǎng)。通過倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)及生長情況;波形絲蛋白(Vimentin,VIM)和角蛋白(Cytokeratin,CK)鑒定其細胞來源;免疫組化染色技術檢測細胞牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白1(dentin matrix protein1,DMP1)、骨橋蛋白(osteopontin,OPN)、骨涎蛋白(bone sialoprotein,BSP)、I型膠原(type I collagen,CoL-I)、III型膠原(typeIII collagen,CoL-III)及纖維連接蛋白(fibronectin,FN)的表達。結(jié)果:細胞形態(tài)呈多形性,有長梭形,紡錘形、不規(guī)則三角形等,波形絲蛋白染色陽性,角蛋白染色陰性。免疫組化染色顯示DMP1陰性表達,OPN、BSP、CoL-I、CoL-III、FN在胞漿中呈不同程度的陽性表達。結(jié)論:大鼠牙囊細胞來源于外胚間充質(zhì),具有成纖維細胞的形態(tài)特征及成骨/成牙骨質(zhì)細胞表型特征,可將牙囊細胞作為種子細胞用于牙周組織工程的再生研究。 第二部分:BMP-2和地塞米松對體外培養(yǎng)大鼠牙囊細胞生物學特性的影響 目的:觀察BMP-2、地塞米松、BMP-2/地塞米松聯(lián)合作用對體外培養(yǎng)大鼠牙囊細胞增殖、分化的影響。方法:取生長狀態(tài)良好的第3代大鼠牙囊細胞,血清饑餓同步化后,分別加入含BMP-2(100ng/ml)、地塞米松Dex (10-8mol/ml)、BMP-2(100ng/ml)+地塞米松(10-8mol/ml)的DMEM培養(yǎng)液,誘導1d、3d、5d后,利用四唑鹽比色法(MTT)檢測不同誘導條件下對大鼠牙囊細胞增殖影響。通過堿性磷酸酶(ALP)檢測試劑盒、鈣化結(jié)節(jié)染色、RT-PCR檢測DMP-1、DSPP、BSP、OCN、Col I基因表達的方法,分別檢測不同誘導條件下對大鼠牙囊細胞分化的影響。結(jié)果:BMP-2、地塞米松分別誘導均能促進牙囊細胞的增殖,誘導3天后BMP-2作用最為顯著,地塞米松則在第1天時促增殖作用最強,其后逐漸降低,然而BMP-2/地塞米松聯(lián)合作用在各個時間點均能顯著促進牙囊細胞的增殖。此外,地塞米松對牙囊細胞的促分化作用強于BMP-2,當兩者聯(lián)合作用時促分化能力最強。結(jié)論: BMP-2、地塞米松均能促進牙囊細胞增殖與分化,然而兩者聯(lián)合作用促增殖和分化的能力最為顯著,提示其在牙周組織工程中的應用前景。 第三部分:BMP-2和地塞米松作用的大鼠牙囊細胞復合β-磷酸三鈣生物陶瓷的實驗研究 目的:以BMP-2和地塞米松誘導的大鼠牙囊細胞作為種子細胞,β-磷酸三鈣作為細胞支架材料,體外構(gòu)建細胞生物材料復合體,觀察大鼠牙囊細胞在β-磷酸三鈣生物陶瓷材料的貼附、增殖情況。方法:收集培養(yǎng)的第3代RDFCs,血清饑餓同步化后,細胞分為四組,分別為BMP-2、Dex、BMP-2+Dex誘導組及空白對照組。誘導3d后,將密度為4×106/ml的細胞懸液0.1ml均勻接種到預制好的β-TCP支架材料上,分別于體外培養(yǎng)3d、7d取細胞材料復合體,通過細胞計數(shù),掃描電子顯微鏡觀察細胞在材料表面的貼附、增殖情況。結(jié)果:細胞計數(shù)發(fā)現(xiàn),7d時BMP-2+Dex誘導組細胞數(shù)量顯著高于BMP-2誘導組、Dex誘導組(p0.01)。掃描電鏡觀察,β-TCP表面呈多孔三維立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。細胞接種3 d和7d時,單位面積內(nèi)BMP-2+Dex誘導組細胞數(shù)量均明顯高于BMP-2誘導組、Dex誘導組、對照組。結(jié)論:β-磷酸三鈣具有良好的生物相容性,利于大鼠牙囊細胞的貼附和生長,證明了BMP-2和地塞米松聯(lián)合作用促進大鼠牙囊細胞的增殖、分化的協(xié)同效應,為進一步使用BMP-2和地塞米松誘導大鼠牙囊細胞,并與β-磷酸三鈣生物陶瓷復合后體內(nèi)移植實驗提供依據(jù)。 第四部分:BMP-2和地塞米松誘導后大鼠牙囊細胞/β-磷酸三鈣生物陶瓷復合體在免疫缺陷鼠體內(nèi)成骨作用的研究 目的:觀察BMP-2、地塞米松、BMP-2+地塞米松對大鼠牙囊細胞在體內(nèi)分化能力的影響。方法:將經(jīng)BMP-2、Dex、BMP-2+Dex誘導后的牙囊細胞與β-TCP生物陶瓷支架材料復合后,移植入免疫缺陷小鼠體內(nèi)8周,取移植物進行HE染色及Masson染色觀察。結(jié)果:HE及Masson染色結(jié)果均表明,BMP-2/Dex聯(lián)合誘導組移植物可見骨組織及類骨質(zhì)形成,并可見血管長入。BMP-2誘導組也可見少量成骨組織。而Dex誘導組、未誘導組及空白對照組均未見骨組織及類骨質(zhì)形成,但在材料孔隙周圍可見細胞及細胞外基質(zhì)成分。結(jié)論:BMP-2/地塞米松協(xié)同誘導的大鼠牙囊細胞與β-TCP生物陶瓷復合后,在體內(nèi)能分化成為成骨/成牙骨質(zhì)細胞樣細胞,并形成骨樣組織。為牙囊細胞/生物材料復合體修復牙周組織缺損提供理論依據(jù)。
【圖文】：

BSP F 5’-ACAGCTGACGCGGGAAAG TTG-3’,R 5’-ACCTGCTCATTTTCATCCACTTC-3’;167bpOCN F5’-ATGAGGACCCTCTCTCTGCTC-3’,R 5’-CTAAACGGTGGTGCCATAGAT-3’;306 bpCol I 5’- CGTGACCAAAAACCAAAAGTG C -35’-GGGGTGGAGAAAGGAACAGAAA-3’;186bpβ-Actin F5’－TGGAATCCTGTGGCATCCATGAAAC－3’R5’－TAAAACGCAGCTCAGTAACAGTCCG－3’346bp計學處理采用 SPSS13.0 統(tǒng)計軟件分析相關數(shù)據(jù)(單樣本 t 檢驗、χ2檢驗有顯著性差異。果 BMP-2、Dex、BMP-2+Dex 分別對體外培養(yǎng)大鼠牙囊細胞堿影響的時間效應7080未誘導BMP-2 *

的數(shù)量及面積明顯存在顯著的差異。其中 BMx 誘導組與未誘導組相比，其礦化結(jié)節(jié)形成量均存在外，BMP-2+Dex 誘導組礦化結(jié)節(jié)形成量明顯大于 BM。然而，，BMP-2 單獨誘導組與 Dex 單獨誘導組間性差異(p>0.01)(圖 2-3)。達的檢測R 產(chǎn)物電泳圖(圖 2-4)顯示：未經(jīng)誘導的牙囊細胞不表及成骨/成牙骨質(zhì)細胞標志分子。BMP-2 誘導的牙囊細胞標志分子 BSP、OCN 及 CoL-I。然而地塞米松、OCN 及 CoL-I 的表達明顯強于 BMP-2 誘導組。此合誘導組在這三種基因表達最為顯著。各組細胞均不分子 DSPP 及 DMP-1mRNA。
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2008
【分類號】：R78

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