【摘要】： 牙周炎是由牙菌斑中微生物所引起的牙周支持組織的慢性感染性疾病,可導(dǎo)致牙周組織炎癥、牙周袋形成、進(jìn)行性附著散失和牙槽骨吸收,甚至牙松動(dòng)和牙脫落。由于牙周組織的再生能力有限,傳統(tǒng)的牙周治療可去除感染及病變組織,修整因牙周病變所造成的軟硬組織缺損,有一定程度的牙槽骨修復(fù)作用,但這種牙周組織的修復(fù)非常有限,不能完全恢復(fù)牙周組織正常生理結(jié)構(gòu)。在實(shí)現(xiàn)牙周組織再生中,牙周膜細(xì)胞充當(dāng)著關(guān)鍵作用,是牙周組織再生和形成新附著的基礎(chǔ)成分。牙周膜細(xì)胞包括牙周膜成纖維細(xì)胞(periodontal ligament fibroblasts,PDLFs)、成骨細(xì)胞、成牙骨質(zhì)細(xì)胞等。但在牙周炎癥或創(chuàng)傷時(shí),牙周膜再生細(xì)胞數(shù)量及其生物學(xué)功能的降低則阻礙了牙周組織的完全再生�；蛑委熂夹g(shù)的出現(xiàn)為實(shí)現(xiàn)牙周再生提供了新的思路。通過基因轉(zhuǎn)移將外源目的基因?qū)氚屑?xì)胞中,既可使治療性蛋白在特定區(qū)域持續(xù)高表達(dá),又能在局部產(chǎn)生微環(huán)境,誘導(dǎo)細(xì)胞定向分化,從而有效促進(jìn)牙周組織再生。 本研究探討超聲微泡介導(dǎo)綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)基因轉(zhuǎn)染人牙周膜成纖維細(xì)胞(human periodontal ligament fibroblasts,HPDLFs)的效率及對(duì)細(xì)胞生長活性的影響,優(yōu)化轉(zhuǎn)染的相關(guān)條件,為進(jìn)一步用基因治療牙周炎提供新思路與實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 目的: 探討超聲微泡造影劑在一定能量的超聲波輻照下,介導(dǎo)pEGFP-N1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HPDLFs的有效性及安全性,為實(shí)現(xiàn)牙周炎的基因治療奠定基礎(chǔ)。 方法: 體外原代培養(yǎng)HPDLFs,以EGFP基因?yàn)閳?bào)告基因,脂質(zhì)微泡造影劑為載體,用超聲輻照微泡介導(dǎo)質(zhì)粒pEGFP-N1轉(zhuǎn)染HPDLFs。根據(jù)影響超聲微泡轉(zhuǎn)染的三個(gè)不同因素和相同因素下不同水平分組,即不同的輻照時(shí)間(10 s、30 s、45 s、60 s)、超聲強(qiáng)度(0.5 W/cm2、1W/cm2)與微泡濃度(10%、15%、20%)共分成24組,計(jì)算出各組的轉(zhuǎn)染率,篩選出具有較高轉(zhuǎn)染率的參數(shù)組合。再以轉(zhuǎn)染率最高的參數(shù)組合為實(shí)驗(yàn)組,分別與質(zhì)粒組、微泡+質(zhì)粒組、超聲+質(zhì)粒組和脂質(zhì)體+質(zhì)粒組比較各組間的轉(zhuǎn)染率。同時(shí)MTT法檢測(cè)在此轉(zhuǎn)染條件下HPDLFs的活性。 結(jié)果: 通過研究不同聲強(qiáng)、輻照時(shí)間、微泡濃度下的轉(zhuǎn)染率,篩選出當(dāng)聲強(qiáng)為0.5 W/cm2、間斷波輻照時(shí)間60 s、微泡濃度15%時(shí)對(duì)HPDLFs具有最高的轉(zhuǎn)染率和較少的細(xì)胞損傷。同時(shí),超聲微泡介導(dǎo)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HPDLFs在轉(zhuǎn)染率方面與傳統(tǒng)的脂質(zhì)體介導(dǎo)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染率相似,但超聲+微泡+質(zhì)粒組中HPDLFs的活力明顯高于脂質(zhì)體+質(zhì)粒組。 結(jié)論: 本實(shí)驗(yàn)以超聲微泡造影劑為基因載體對(duì)體外培養(yǎng)的HPDLFs進(jìn)行轉(zhuǎn)染,并與傳統(tǒng)的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法進(jìn)行比較,探討合適的超聲微泡轉(zhuǎn)染條件及其對(duì)HPDLFs生長活性的影響。證實(shí)超聲微泡能有效地介導(dǎo)外源基因在HPDLFs中安全、有效的轉(zhuǎn)染與表達(dá),有望成為一種安全、有效的基因轉(zhuǎn)染方法,為實(shí)現(xiàn)牙周再生的基因治療奠定了基礎(chǔ)。
【圖文】：

（圖 1-1-1）從組織塊邊緣游出的細(xì)胞（100×）G. 1-1-1)Cells emigrating form edge ofsue（圖 1-1-2）第九天原代培養(yǎng)的牙周纖維細(xì)胞（100×）(FIG. 1-1-2) primary culture HPDLFthe ninth day（圖 1-1-4）HPDLFs 波形蛋白免疫細(xì)胞化學(xué)染色陽性（100×）(Fig.1-1-4) primary culture HPDLFscytochemical staining vimentin is masc.（圖 1-1-5）HPDLFs 角蛋白免疫細(xì)胞學(xué)染色陰性（100×）(Fig.1-1-5) Primary culture HPDLcytochemical staining keratin is negativ

第 3 代 HPDLFs 的免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果：抗波絲蛋白在細(xì)胞漿中呈陽性表達(dá)（細(xì)胞將呈棕黃色），而角蛋白染色陰性（圖 1-1-4，，1-1-5）。（圖 1-1-1）從組織塊邊緣游出的細(xì)胞（100×）(FIG. 1-1-1)Cells emigrating form edge oftissue（圖 1-1-2）第九天原代培養(yǎng)的牙周膜成纖維細(xì)胞（100×）(FIG. 1-1-2) primary culture HPDLFs othe ninth day
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R781.4

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本文編號(hào)：2609670