【摘要】：目的:慢性牙周炎是一種以牙周致病菌為始動(dòng)因子、宿主免疫反應(yīng)介導(dǎo)的復(fù)雜的慢性感染性疾病。牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis,P.gingivalis)是慢性牙周炎的主要致病菌。P.gingivalis唾液酸酶基因是P.gingivalis編碼唾液酸酶的唯一基因,敲除該基因可以嚴(yán)重影響其莢膜合成、生物膜形成及牙齦素活性等,降低P.gingivalis抵抗宿主免疫防御的能力,在慢性牙周炎的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起到了重要的作用。因此,抑制唾液酸酶基因轉(zhuǎn)錄、表達(dá)或其產(chǎn)物(唾液酸酶)的活性,有望成為預(yù)防、減緩或治療慢性牙周炎發(fā)生發(fā)展的新方向。2-脫氧-2,3-二脫氫-N-乙酰神經(jīng)氨酸(DANA)是唾液酸的重要衍生物,對(duì)某些細(xì)菌唾液酸酶具有較高的抑制效能。本研究目的是通過(guò)唾液酸酶抑制劑DANA抑制P.gingivalis唾液酸酶活性后,研究P.gingivalis的生長(zhǎng)情況及毒力因子的變化,旨在探索DANA影響抑制牙周致病菌P.gingivalis致病性的可能機(jī)制,為應(yīng)用DANA進(jìn)行慢性牙周炎的預(yù)防和治療提供新的研究思路和理論依據(jù)。研究方法:本實(shí)驗(yàn)選用P.gingivalis W83作為實(shí)驗(yàn)菌株,采用MTS法檢測(cè)不同濃度廣譜唾液酸酶抑制劑DANA和流感病毒唾液酸酶特異性抑制劑奧司他韋對(duì)人單核細(xì)胞U937的毒性作用,再使用不同濃度DANA和奧司他韋處理P.gingivalis后采用熒光法檢測(cè)唾液酸酶活性,聯(lián)合確定DANA作用于P.gingivalis的合適濃度。1 mM DANA作用于P.gingivalis W83(實(shí)驗(yàn)組),用未加藥物的P.gingivalis W83作對(duì)照,通過(guò)酶標(biāo)儀檢測(cè)OD_(600),繪制生長(zhǎng)曲線;通過(guò)透射電鏡觀察細(xì)菌的形態(tài);體外形成生物膜,通過(guò)活/死菌熒光染色及激光共聚焦顯微鏡觀察生物膜的結(jié)構(gòu)變化;Real-time PCR法檢測(cè)菌毛基因fimA、fimR和fimS的表達(dá)情況;使用蛋白底物測(cè)定賴(lài)氨酸蛋白酶(Kgp)和精氨酸蛋白酶(Rgps)的活性;通過(guò)基質(zhì)顯色法鱟試劑盒檢測(cè)脂多糖(LPS)的活性。結(jié)果:1、MTS法結(jié)果顯示,當(dāng)DANA濃度為0.1、1、10mM時(shí),人單核細(xì)胞U937的相對(duì)增殖率分別為97.61±2.68%、93.75±7.87%和60.98±5.80%;當(dāng)奧司他韋濃度為0.1、1、10 mM時(shí),人單核細(xì)胞U937的相對(duì)增殖率分別為96.59±2.93%、93.35±3.86%和76.93±10.05%。唾液酸酶活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)表明DANA對(duì)P.gingivalis唾液酸酶活性產(chǎn)生了抑制作用,且抑制作用顯著強(qiáng)于奧司他韋。當(dāng)DANA濃度為0.2、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mM時(shí),唾液酸酶活性抑制率分別達(dá)47.13%、59.15%、72.01%、72.69%、72.79%、71.77%。因此,在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中我們選擇使用1 mM的DANA,使其對(duì)細(xì)胞僅產(chǎn)生適當(dāng)?shù)亩拘宰饔们夷苊黠@抑制P.gingivalis唾液酸酶活性。2、通過(guò)生長(zhǎng)曲線可觀察到濃度為1 mM的DANA可明顯抑制P.gingivalis的生長(zhǎng)。通過(guò)活/死菌熒光染色及激光共聚焦顯微鏡觀察P.gingivalis生物膜,發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組細(xì)菌生物膜中綠色活菌數(shù)量顯著少于對(duì)照組;對(duì)照組細(xì)菌生物膜平均厚度為54μm,而實(shí)驗(yàn)組的平均厚度僅為33μm。3、透射電鏡觀察細(xì)菌形態(tài)發(fā)現(xiàn),1 mM的DANA作用下P.gingivalis細(xì)菌懸液中細(xì)菌形態(tài)正常,細(xì)胞壁和細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整,其與未經(jīng)處理的P.gingivalis的細(xì)胞結(jié)構(gòu)相似。4、與對(duì)照組比較,實(shí)驗(yàn)組fimA、fimR和fimS基因mRNA表達(dá)分別下降76.34%±6.59%、42.55%±6.77%和50.02%±5.24%,組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的Kgp活性的OD值分別為0.53±0.02和0.62±0.03;Rgps活性的OD值分別為0.72±0.07和0.96±0.08,實(shí)驗(yàn)組Kgp和Rgps活性均低于對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的LPS活性相比無(wú)顯著性差異。結(jié)論:濃度為1 mM的DANA可顯著抑制P.gingivalis唾液酸酶活性,影響P.gingivalis的生長(zhǎng)及生物膜的形成,降低菌毛基因的表達(dá),影響牙齦素的活性,有望成為預(yù)防及治療慢性牙周炎的新型藥物。
【圖文】：

1 2-脫氧-2,3-二脫氫-N-乙酰神經(jīng)氨酸（DANA）的化學(xué)結(jié)構(gòu)式及細(xì)胞3（由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院 口腔生物學(xué)教研室提供37 （購(gòu)自北京貝納創(chuàng)聯(lián)生物科技有限公司）胞的培養(yǎng)valis W83 菌株接種于新鮮配制的含有維生素 K（1 μg/m和 5%無(wú)菌脫纖維綿羊血的 TSB 固體培養(yǎng)基中，37℃厭80% N2）5-7 d 后，將其置于含有維生素 K（1 μg/mL）的 TSB 液體培養(yǎng)基中增菌，待用。U937在含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，在3養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，800 rpm/min 離心 5 min，換液。臺(tái)盼

3 結(jié)果3.1 DANA 對(duì)人單核細(xì)胞 U937 增殖的影響圖2顯示了MTS法分析結(jié)果顯示0.1 mM和1 mM的DANA對(duì)人單核細(xì)胞U937無(wú)明顯的細(xì)胞毒性作用，0.1 mM、1 mM 和 10 mM 的奧司他韋對(duì)人單核細(xì)胞 U937無(wú)明顯的細(xì)胞毒性作用。在本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，當(dāng) DANA 濃度為 0.1 、1 和 10 mM 時(shí)，人單核細(xì)胞 U937 的相對(duì)增殖率分別為 97.61 ± 2.68％、93.75 ± 7.87％和 60.98 ±5.80％；當(dāng)奧司他韋濃度為 0.1 、1 和 10 mM 時(shí)，人單核細(xì)胞 U937 的相對(duì)增殖率分別為 96.59 ± 2.93％、93.35 ± 3.86％和 76.93 ± 10.05％。圖 2 不同濃度的 DANA 及奧司他韋對(duì)人單核細(xì)胞 U937 增殖的影響（*P < 0.05）3.2 DANA 對(duì) P. gingivalis 唾液酸酶活性的影響圖 3 顯示了不同濃度的 DANA 及奧司他韋處理后的 P. gingivalis W83 唾液酸酶相對(duì)活性。當(dāng) DANA 濃度為 0.2、0.5、1、1.5、2、2.5 mM 作用于 P. gingivalis W83時(shí)，P. gingivalis W83 唾液酸酶相對(duì)活性分別為 52.87%、40.85%、27.99%、27.31%、27.21%、28.23%，即唾液酸酶活性抑制率分別達(dá) 47.13%、59.15%、72.01%、72.69%、72.79%、71.77%。當(dāng)奧司他韋濃度為 0.2、0.5、1、1.5、2、2.5 mM 作用于 P. gingivalisW83時(shí)，，P. gingivalis W83唾液酸酶相對(duì)活性分別為79.54%、74.38%、70.14%、65.17%、71.71%、78.63%
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R781.4

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本文編號(hào)：2607132