【摘要】：牙齦是牙周組織的天然屏障,不僅對機體狀態(tài)、口腔環(huán)境變化敏感,容易在多種藥物使用后產(chǎn)生增生等疾病表型,而且具有強大的損傷后愈合能力,這些現(xiàn)象暗示牙齦組織中可能存在對組織動態(tài)平衡和損傷修復(fù)具有重要作用的未分化間充質(zhì)干細(xì)胞。近年來多種口腔頜面部組織中都被證明含有間充質(zhì)干細(xì)胞,并表現(xiàn)出相應(yīng)組織特異干細(xì)胞的特性,為利用口腔頜面部間充質(zhì)干細(xì)胞進行疾病干預(yù)治療和組織修復(fù)再生奠定了基礎(chǔ)。而目前在細(xì)胞水平對牙齦生物學(xué)的研究集中于牙齦上皮細(xì)胞和牙齦固有層成纖維細(xì)胞,后者作為一群異質(zhì)性較強的細(xì)胞,雖然有報道其表現(xiàn)出了干細(xì)胞特性,但尚無研究針對牙齦固有層中間充質(zhì)干細(xì)胞的身份和功能進行鑒定和分析。本研究采用通常鑒定干細(xì)胞的思路和方法進行研究,通過檢測原位標(biāo)志物、體外行為和體內(nèi)功能等方面的指標(biāo),勾勒出牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞的身份特征,并揭示其在牙齦增生發(fā)生機制和相關(guān)免疫疾病治療方面的潛在作用。 所取得的主要研究結(jié)果如下: 1.增生牙齦組織中固有層較正常牙齦增厚,I型膠原(COL-I)等細(xì)胞外基質(zhì)成分更豐富,高表達Ki-67和增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)等增殖指標(biāo),說明細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)調(diào)節(jié)的紊亂與牙齦增生表型密切相關(guān)。正常和增生牙齦固有層均存在表達STRO-1和階段特異性胚胎表面抗原-4(SSEA-4)的細(xì)胞,說明牙齦固有層中確實存在具有干細(xì)胞表型和功能的細(xì)胞群體,在標(biāo)志蛋白表達上兩種組織中干細(xì)胞的比例并無差別。 2.通過克隆化培養(yǎng),從正常和增生牙齦組織中獲得了貼壁生長的牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞。在相同條件下,低密度接種于培養(yǎng)板上的牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞產(chǎn)生的克隆數(shù)量近似于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。經(jīng)過長期擴增后,無論是來自正常牙齦或增生性牙齦的牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞均能保持與初始培養(yǎng)時相近的倍增時間,體現(xiàn)出牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞具有某種維持細(xì)胞周期循環(huán)活動的分子機制,促使細(xì)胞在增殖刺激原作用下始終具有高反應(yīng)性。與此相應(yīng),牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞具有較高的群體倍增值,證明其具有持續(xù)增殖的能力。流式細(xì)胞學(xué)的分析確定了這些細(xì)胞在擴增后仍然保持了間充質(zhì)干細(xì)胞的表面標(biāo)志,表明未分化干細(xì)胞的特性并未喪失。 3.經(jīng)過單細(xì)胞克隆化培養(yǎng)的牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞在成骨誘導(dǎo)后,正常組和增生組均能形成明顯的礦化結(jié)節(jié),呈現(xiàn)茜素紅染色陽性,并表現(xiàn)出較強的骨涎蛋白(BSP)、骨鈣素(OCN)、堿性磷酸酶(ALP)等礦化基因的表達。成脂誘導(dǎo)液誘導(dǎo)3 w后,經(jīng)過油紅O染色的牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞內(nèi)部出現(xiàn)紅色脂滴,同時表達成脂分化關(guān)鍵基因過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)和CCAAT增強子結(jié)合蛋白α(C/EBPα)。在以細(xì)胞團形式接受成軟骨誘導(dǎo)后,牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞形成類似于軟骨細(xì)胞的形態(tài)和網(wǎng)格狀排列,對甲苯胺藍表現(xiàn)出強陽性染色,表達軟骨細(xì)胞標(biāo)志II型膠原A1(COL2A1)和蛋白聚糖(ACAN)。這些結(jié)果證明了正常和增生牙齦來源間充質(zhì)干細(xì)胞的多能性。 4.免疫細(xì)胞化學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)基質(zhì)金屬蛋白酶-1(MMP-1)在增生牙齦來源牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞中的表達明顯低于正常牙齦來源的牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞,而兩組細(xì)胞均陽性表達基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1(TIMP-1),表達強度無明顯差異。將正常和增生牙齦來源間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合纖維蛋白膠植入裸鼠皮下,4周后形成的組織富含長梭形細(xì)胞和膠原等細(xì)胞外基質(zhì),類似于天然的牙齦固有層組織,說明牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞具有再生出自身來源組織的能力。同時,增生牙齦來源間充質(zhì)干細(xì)胞在體內(nèi)植入后表現(xiàn)出了比正常牙齦來源間充質(zhì)干細(xì)胞更強的膠原形成能力。這表明增生組織來源的牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞具有重現(xiàn)增生牙齦固有層所具有的大量膠原纖維的能力,可能與調(diào)節(jié)基質(zhì)改建的MMP表達變化有關(guān)。通過連續(xù)移植實驗,正常牙齦來源間充質(zhì)干細(xì)胞組未取得移植物,而增生牙齦來源間充質(zhì)干細(xì)胞能繼續(xù)形成富含基質(zhì)成分的組織,反映了增生組織來源的牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞具有更強的體內(nèi)自我更新能力。 5.通過建立異基因系小鼠間皮膚移植模型,模擬異體抗原誘導(dǎo)的免疫排斥反應(yīng),PBS溶液注射組的受體小鼠出現(xiàn)迅速強烈的排斥反應(yīng),而注入正常和增生牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞組的受體小鼠則延緩了免疫排斥反應(yīng)的發(fā)生速率,表明牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞在體內(nèi)環(huán)境中具有十分確定的對免疫排斥反應(yīng)的抑制作用。大體和組織形態(tài)學(xué)觀察驗證了牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞對皮膚移植排斥的抑制作用,反映在局部組織炎性細(xì)胞浸潤較少、組織維持正常的層級結(jié)構(gòu)和細(xì)胞成分等方面�；旌狭馨图�(xì)胞反應(yīng)試驗證明上述體系中人牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞對小鼠移植皮膚免疫排斥的抑制作用并非通過抑制淋巴細(xì)胞增殖實現(xiàn),而流式細(xì)胞學(xué)分析證明與正常和增生組織來源牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)后的小鼠T淋巴細(xì)胞中表達CD4、CD25和FOXP3的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例明顯上升,進一步通過在小鼠皮膚移植前加入抗CD25抗體處理剔除其體內(nèi)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞,觀察到外源性牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞對免疫排斥反應(yīng)的抑制作用消失,移植物排斥速度快于對照組,不僅說明調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在移植物耐受方面具有關(guān)鍵作用,而且證實其也是外源性牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞發(fā)揮體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)功能的重要途徑。 綜上,本研究首次鑒定和分析了正常和增生牙齦組織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞,揭示了其在組織再生和免疫調(diào)節(jié)方面的性能,并且提出了基于干細(xì)胞的牙齦增生發(fā)生機制,不僅為細(xì)胞治療研究提供了新的來源選擇,也為進一步研究牙齦增生的發(fā)病機制和干預(yù)策略提供了新的策略。
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R781.4

【引證文獻】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 鄭怡;水蛭素對牙齦成纖維細(xì)胞bFGF及TGF-β_1表達的影響[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2013年

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本文編號：2601090