【摘要】：目的：本研究為前期本實驗室將異體同種骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Bone marrowmesenchymal stem cells BMSCs）懸液經(jīng)山羊頸靜脈注射致急性肺栓塞發(fā)生故設(shè)計探索性的實驗，目的在于比較4℃恒溫條件下短期保存對小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（C57-BMSCs）的細(xì)胞活性及生物學(xué)特性是否產(chǎn)生影響，為短期安全有效的保存BMSCs提供參考，探索使用DNA酶Ⅰ（DeoxyribonucleaseⅠ DNaseⅠ）預(yù)處理后的注射用BMSCs經(jīng)尾靜脈注射至同種異體小鼠體內(nèi)的移植方式，能夠起到降低直接血管內(nèi)移植導(dǎo)致發(fā)生急性肺栓塞的風(fēng)險。為將來在臨床或口腔組織工程領(lǐng)域應(yīng)用提供安全性參考。 方法：（1）體外無菌分離培養(yǎng)純化C57-BMSCs，鑒定BMSCs的骨向、脂向分化能力，經(jīng)流式對其的表面分子標(biāo)志物表達(dá)程度檢測。（2）磷酸鹽的緩沖液（PhosphateBuffered Saline PBS）作為C57-BMSCs的短期儲存液，直接將BMSCs置于4℃恒溫保存，存儲0h、4h、12h、24h及48h后取試樣，鏡檢細(xì)胞、測算統(tǒng)計活細(xì)胞比例、比較增殖和分化能力。（3）對正常C57-BMSCs和DNaseⅠ預(yù)處理后C57-BMSCs懸液細(xì)胞聚集狀態(tài)及體外增殖、分化能力進(jìn)行比較。（4）將體外分離、培養(yǎng)、純化后的C57-BMSCs擴(kuò)增至第三代。將C57小鼠隨機(jī)分為四組：注射PBS組（n=30）、注射10U/mlDNaseⅠ-PBS組（n=30）、注射正常C57-BMSCs組（n=30）、注射DNaseⅠ預(yù)處理后C57-BMSCs組（n=30）。（5）注射PBS組與注射正常C57-BMSCs組每只小鼠以5ml/kg的比例，分別經(jīng)尾靜脈注射相應(yīng)劑量的PBS或本實驗室前期試驗摸索得到（3×106cell）的臨界致死劑量C57-BMSCs，取急性死亡小鼠臟器做組織學(xué)檢測，，注射PBS組做對照，觀察記錄并統(tǒng)計急性死亡率。（6）注射DNaseⅠ預(yù)處理后C57-BMSCs組，每只小鼠按5ml/kg比例注射DNaseⅠ預(yù)處理后3×106個C57-BMSCs觀察急性死亡率。 結(jié)果：（1）于4℃恒溫條件下短期保存C57-BMSCs4h、12h和24h后取樣鏡下觀察見良好的形態(tài)、活細(xì)胞占80%左右，細(xì)胞增殖、分化能力上相比于0h無統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05）；48h取樣后鏡下見悉數(shù)視野的死細(xì)胞和細(xì)胞碎片、僅20%左右為活細(xì)胞，與0h相比細(xì)胞增殖、分化能力上存顯著性差異（P0.05）。（2）DNaseⅠ預(yù)處理不影響C57-BMSCs增殖、分化能力（P0.05）；DNaseⅠ預(yù)處理C57-BMSCs與正常C57-BMSCs相比細(xì)胞聚集成團(tuán)比例顯著降低（P0.05）。（3）與注射PBS組相比，注射正常C57-BMSCs組的急性死亡率是60%、組織學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)心肺異常并且肺血管內(nèi)有異染物質(zhì)，誘發(fā)了急性肺栓塞。（4）注射DNaseⅠ預(yù)處理后C57-BMSCs組的急性死亡率降為23.3%，與注射正常C57-BMSCs組相比有統(tǒng)計學(xué)差異（P0.05）。 結(jié)論：（1）4℃恒溫條件下24h內(nèi)短期保存C57-BMSCs為一種簡單易行的保存方法。但是，細(xì)胞生物學(xué)特性與活性隨保存時間延長是呈逐漸下降的，并直至喪失。（2）DNaseⅠ預(yù)處理不影響C57-BMSCs的生物學(xué)特性,DNaseⅠ能夠降低經(jīng)靜脈注射移植C57-BMSCs懸液中單個細(xì)胞間聚集所誘發(fā)急性肺栓塞風(fēng)險的發(fā)生。為將來臨床或口腔組織工程領(lǐng)域的應(yīng)用提供了一定的安全性參考。
【圖文】：

圖1-1 C57 小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)鏡下圖片（20×）注：a 為原代C57-BMSCs；b 為一代C57-BMSCs；c 為二代C57-BMSCs；d 為三代C57-BMSCs。圖1-2 C57-BMSCs 成骨誘導(dǎo) 7 天ALP、21 天茜素紅染色注：a 正常培養(yǎng)7d ALP 染色大體照及鏡下（20×）；b 成骨誘導(dǎo)7d ALP 染色大體照及鏡下（20×）；c 正常培養(yǎng)21d 茜素紅染色大體照及鏡下（20×）；d 成骨誘導(dǎo)21d茜素紅染色大體照及鏡下（20×）。

C57-BMSCs成骨誘導(dǎo)7天ALP、21天茜素紅染色注：a正常培養(yǎng)7dALP染色大體照及鏡下（20×）；b成骨誘導(dǎo)7dALP染色大體照及鏡下（20×）；c正常培養(yǎng)21d茜素紅染色大體照及鏡下（20×）；d成骨誘導(dǎo)21d茜素紅染色大體照及鏡下（20×）
【學(xué)位授予單位】：佳木斯大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R781.05

【參考文獻(xiàn)】

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1 陳波;俞惠新;譚成;林秀峰;張莉;曹國憲;羅世能;;碘標(biāo)白藜蘆醇及其小鼠體內(nèi)分布[J];原子能科學(xué)技術(shù);2008年06期

本文編號：2598207