【摘要】： 牙髓炎、根尖周炎和牙周炎等疾病均是G~-厭氧細(xì)菌為主的混合感染，而G~-細(xì)菌的主要毒力因子就是內(nèi)毒素。因此，內(nèi)毒素解毒劑有益于口腔疾病的治療和預(yù)防。內(nèi)毒素(endotoxins，ET)是G~-細(xì)菌外膜組份，其化學(xué)本質(zhì)是脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)，由O-特異性多糖鏈、核心寡糖和類脂A構(gòu)成，類脂A是內(nèi)毒素結(jié)構(gòu)中最保守部分，也是內(nèi)毒素的“毒力中心(endotoxic principle)”，所以類脂A是中和內(nèi)毒素活性的理想靶標(biāo)。用小分子中和內(nèi)毒素活性是一個(gè)活躍的研究方向，高親和力是小分子中和內(nèi)毒素活性的前提和關(guān)鍵，小分子分為肽類和非肽類，肽類是研究的主要方向。噬菌體展示肽庫(kù)提供了一種根據(jù)親和力高低從大量隨機(jī)肽序列中篩選目標(biāo)短肽的方法。本研究以類脂A為靶標(biāo)篩選噬菌體展示肽庫(kù)，化學(xué)合成其中一條肽序列并評(píng)價(jià)其在內(nèi)毒素中和過程中的作用，主要進(jìn)行了以下實(shí)驗(yàn)： 一 應(yīng)用噬菌體展示肽庫(kù)技術(shù)篩選內(nèi)毒素類脂A部分的結(jié)合肽 用氯仿：甲醇(4：1)混合液溶解類脂A，用甲醇稀釋到所需濃度包被酶聯(lián)板孔10μg/孔；以類脂A為靶標(biāo)篩選噬菌體展示十二肽庫(kù)，共篩選三輪；挑選第三輪篩選到的噬菌體，進(jìn)行ELISA和競(jìng)爭(zhēng)ELISA鑒定，然后測(cè)序，ELISA結(jié)果顯示，大部分第三輪洗脫的噬菌體特異結(jié)合于包被的類脂A，表明這種包被類脂A的方法是可行的。用20μg/孔的多粘菌素B可以完全競(jìng)爭(zhēng)抑制噬菌體克隆和類脂A的結(jié)合，進(jìn)一步表明這種方法包被的類脂A能夠被多粘菌素B識(shí)別，并且篩選到的噬菌體克隆和多粘菌素B在類脂A上的結(jié)合位點(diǎn)相近或相 中文摘要 同。測(cè)序結(jié)果顯示，其中一條肽AI（HLFNVS－）和多粘菌素B （ttio－K’TK’七 1KK且叢里對(duì)）的部分氨基酸組合相似（下劃線標(biāo)出的殘基人 使用NCBI上的BLASTP尋找最匹配的短序列，可以發(fā)現(xiàn)有些蛋白質(zhì)含有與 AI氨基酸組合相似的氨基酸序列，這提示這些蛋白質(zhì)可能與類脂A結(jié)合。用 AI全部和部分氨基酸序列檢索美國(guó)專利數(shù)據(jù)庫(kù)，沒有發(fā)現(xiàn)申請(qǐng)保護(hù)這段序列的 專利，用這段序列中的“ LKK（亮氨酸一賴氨酸一賴氨酸）”檢索到三個(gè)有關(guān)內(nèi)毒 素結(jié)合和／或中和肽的專利，，這些專利申請(qǐng)保護(hù)的多個(gè)序列含有LKK組合。 用蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)軟件分析了AI肽的一些重要參數(shù)。 二 類脂A結(jié)合肽的化學(xué)合成及其在內(nèi)毒素中和過程中的作用 固相化學(xué)合成 AI序列，CIS柱純化合成肽，在 THP－l細(xì)胞模型和小鼠內(nèi)毒 素致死模型上觀察合成肽的作用。 合成肽的終產(chǎn)物純度為98．56％，質(zhì)譜測(cè)定的合成肽分子量為1495．7與理 論分子量 1495了7一致。 THP一細(xì)胞在本培養(yǎng)條件下基本上不分泌TNFa，這主要得益于無內(nèi)毒素 操作。隨著培養(yǎng)液中內(nèi)毒素（E colt Oill：B4，Sigma濃度的升高，THPI細(xì)胞分 泌 TNFa的量呈“了”狀升高；內(nèi)毒素濃度在 sng／inl和 200ng／ml的范圍內(nèi)時(shí)， TNF七分泌量呈線性上升，所以選用 50ng／ffil LPS作為刺激濃度。20％FBS， 多粘菌素B可降低內(nèi)毒素刺激THPl細(xì)胞分泌IN’－－－a，4pg／ml多粘菌素B自 夠使 TNF0分泌量降低 43．9％。MTh法檢測(cè) THP－l細(xì)胞活力，高濃度多粘菌 素B使細(xì)胞活力下降，但多粘菌素B宅4p咖1時(shí)不影響活力。無血清時(shí)，合成 肽調(diào)理增強(qiáng)內(nèi)毒素刺激THP－1細(xì)胞的能力，類似于LBP 20％FBS時(shí)，合成肽 的這種調(diào)理素樣作用不明顯；20％FBS時(shí)，合成肽增強(qiáng)多粘菌素B中和內(nèi)毒素 的能力。表明這段肽較LBP更傾向于把內(nèi)毒素轉(zhuǎn)運(yùn)向中和途徑。 預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，C57BL／6J小鼠對(duì)內(nèi)毒素的敏感程度大于Balb／c小鼠， Balb兒 ’J’鼠對(duì)內(nèi)毒素的敏感程度大于昆明鼠。腹膜內(nèi)注射 D一氨基半乳糖 10mg 致敏C57BL歷J小鼠（體重。14g），再腹膜內(nèi)注射內(nèi)毒素100ng可以得到100％ 死亡率團(tuán)用卜合成肽單獨(dú)不能降低內(nèi)毒素致死模型小鼠的死亡率p侶）；10pg多 粘菌素 B可以中和 100fig內(nèi)毒素作用，完全保護(hù)小鼠仰卜腹膜內(nèi)注射 D一氨基 2 中文摘要 半乳糖 10mg致敏后，lpg多粘菌素 B不能降低 200ng內(nèi)毒素導(dǎo)致的小鼠死亡 率侶／8）；l吃多粘菌素 B和 50陽合成肽能降低 200ng內(nèi)毒素導(dǎo)致的小鼠死亡率 （4／8）。 三 修飾后的獎(jiǎng)脂A結(jié)合肽在內(nèi)年景中和過征中作用的初步研究 AI肽的氨基酸序列（HLNSH一S）和另外一條報(bào)道的內(nèi)毒素中和 肽GZ的氨基酸序列h＊－G’對(duì)山紅土生（K”）生）存在一些相同的氨基酸組合 （帶下劃線的殘基），陰影著重標(biāo)出了疏水氨基酸。根據(jù)GZ肽的結(jié)構(gòu)，新設(shè)計(jì) 一條肽序歹 AI：＊＊。－H’l‘FgN‘VYHSW4L‘K‘”’沁，K’連接于 K‘的。位氨 基，K’連接于 K‘的 a位氨基。固相化學(xué)合成 AI’肽，終產(chǎn)物的純度為 94．9％， 質(zhì)譜測(cè)定的合成肽分子量為1535石，與理論分子量1535．86相符。 10％FBS時(shí)，30ng／ml TPA活化 THP
【圖文】：

應(yīng)用噬菌體展示肚庫(kù)技術(shù)篩選內(nèi)毒素類脂A部分的結(jié)合膚2.5多月太序列的初步分析經(jīng)軟件計(jì)算，Al膚的pHi值約為l0.6(圖1一2):不穩(wěn)定系數(shù)(II)為9.97，這表明這段膚是穩(wěn)定的;由于該序列的N端為組氨酸，所以估計(jì)的半衰期為3.5小時(shí)(哺乳動(dòng)物網(wǎng)狀細(xì)胞，體外);把多膚序列重復(fù)一次成24個(gè)氨基酸殘基進(jìn)行Eisenberg疏水性分析(圖1一3)，結(jié)果顯示Al膚序列的N端為疏水區(qū)，C端為親水區(qū)。Al月太的螺旋輪(hehcalwheel)顯示該分子有一定的雙歧性、(amphipathieity)[“·‘5〕。Notohorgep曰i~O，0.615圖1一2Al膚的理論滴定曲線

咖娜田卜期圖2一1落卜‘o.c器刁的夕TI翻甘3日..形R勺陣閉‘妞::.自響悅目喊..團(tuán)‘.d名長(zhǎng)防‘.側(cè)比闊.由D日aF白‘妞::-0..‘沖臼曰C.宙?zhèn)忍锬c曰甘目】節(jié).0.二翻習(xí)O口2”:溺17亡試獲L腸沙MJ峨甲自月下資】凡目口八幾O以:了六宮.叫，.叫匕..目C嘴翔勺翻山曰，M腳O州汗鍺洲叫口陽曰刀‘即份.叼臼r.，知孫“...州月抽卜.口腸書份少.口rl叼目州匆側(cè).爪勺相.即，目。，角‘公曰二腸二國(guó)爭(zhēng)，33舀搶‘內(nèi)翻...，用曰.，‘，曰峨丫.目到..d.于口門戶了目潤(rùn)憶心N洲口，護(hù)..白n腸民月尾曰p“抽
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2003
【分類號(hào)】：R780.2

【參考文獻(xiàn)】

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1 王華東,王彥平,戚仁斌,陸大祥,顏亮,李楚杰;二甲亞砜對(duì)家兔內(nèi)毒素性發(fā)熱的影響[J];中國(guó)病理生理雜志;2000年06期

2 孫葳,陸大祥,丁勇,李楚杰;甘氨酸對(duì)內(nèi)毒素與單核細(xì)胞結(jié)合率及內(nèi)毒素構(gòu)型的影響[J];中國(guó)病理生理雜志;1998年04期

本文編號(hào)：2597069