【摘要】：研究背景 慢性牙周炎是由菌斑微生物引起的慢性非特異性炎癥,以造成牙周組織破壞、牙槽骨吸收和病理性牙周袋為特征,引起牙周支持組織的破壞,導(dǎo)致牙齒松動脫落,是造成成年人后天性牙齒缺失的主要原因。學(xué)者們按照循證醫(yī)學(xué)的原則進(jìn)行了大規(guī)模的流行病學(xué)觀察或病例對照研究,并采用科學(xué)的統(tǒng)計分析方法,發(fā)現(xiàn)牙周感染可能是心腦血管疾病、糖尿病、妊娠并發(fā)癥、呼吸道感染、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病的獨立危險因素,或兩種疾病具有共同危險因素。 慢性牙周炎是發(fā)生在口腔局部的炎癥性疾病,糜爛的牙周袋上皮為細(xì)菌、細(xì)菌產(chǎn)物和炎癥介質(zhì)的慢性來源。這么大面積的隱匿病灶如果長期存在不加以控制,不僅造成口腔局部嚴(yán)重的炎癥,破壞牙周支持組織,細(xì)菌及其有毒產(chǎn)物、炎癥介質(zhì)還可以通過血液進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng),感染其他器官；此外,還會啟動機(jī)體的免疫應(yīng)答,使宿主細(xì)胞釋放細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì),導(dǎo)致機(jī)體處于炎癥狀態(tài)。 糖尿病被世界衛(wèi)生組織定為目前嚴(yán)重影響全人類健康的三大疾病之一,在全球的發(fā)病情況不容樂觀。Ⅱ型糖尿病也稱非胰島素依賴型糖尿病,源于組織對胰島素的敏感性降低,即胰島素抵抗現(xiàn)象和胰島素產(chǎn)生障礙,是胰島素分子或其受體水平的缺陷狀態(tài)。牙周炎作為糖尿病的第六大并發(fā)癥,它與糖尿病之間的關(guān)系一直是學(xué)術(shù)界研究的重點。目前,糖尿病與牙周炎二者之間的雙向關(guān)系已經(jīng)被證實。糖尿病是牙周炎的獨立危險因素,慢性牙周炎不利于糖尿病患者的血糖控制。 II型糖尿病胰島病變的特點之一是p細(xì)胞數(shù)量不足,凋亡增加。發(fā)生II型糖尿病時,胰島素敏感組織產(chǎn)生的炎癥因子導(dǎo)致循環(huán)系統(tǒng)中IL-6和TNF-a水平升高。多種細(xì)胞因子都對p細(xì)胞凋亡有誘導(dǎo)作用。促炎癥因子(IL-1, TNFα, IFNγ)可以通過一氧化氮使鈣離子在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)集聚,破壞鈣離子依賴蛋白,使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力增加,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。除此之外,TNF-a可能直接作用于胰島細(xì)胞凋亡。IL-1β會導(dǎo)致Fas表達(dá)的增加,促進(jìn)p細(xì)胞凋亡；IL-1β還能促進(jìn)蛋白激酶C的活化,通過凋亡機(jī)制引起胰島p細(xì)胞的破壞。 目前國內(nèi)外尚未見到關(guān)于慢性牙周炎對T2DM的胰腺影響的研究。課題組前期研究發(fā)現(xiàn),在肥胖大鼠模型中,牙周炎可以促進(jìn)胰島素抵抗的發(fā)展,促進(jìn)胰島結(jié)構(gòu)紊亂,并與胰島素抵抗指數(shù)呈正相關(guān),提示在低度慢性炎癥機(jī)體下,牙周炎可能通過促進(jìn)胰島細(xì)胞的破壞而影響其功能。因此,本研究在前期研究基礎(chǔ)上,擬通過建立II型糖尿病OLETF大鼠合并牙周炎的動物模型,研究牙周炎對糖尿病機(jī)體胰島細(xì)胞凋亡相關(guān)機(jī)制的影響,初步探討牙周炎對糖尿病大鼠胰腺病變的影響及可能機(jī)制。 第一章牙周炎復(fù)合糖尿病大鼠模型的建立 目的 利用自發(fā)II型糖尿病的OLETF大鼠,通過絲線結(jié)扎聯(lián)合涂菌法,建立II型糖尿病復(fù)合牙周炎模型,為進(jìn)一步研究牙周炎對II型糖尿病大鼠胰島組織形態(tài)和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)奠定基礎(chǔ)。 方法 (1)自發(fā)Ⅱ型糖尿病OLETF大鼠30只,4周齡,雄性;其同種系同周齡糖耐量正常對照LETO大鼠20只。OLETF大鼠和LETO大鼠實行牙周炎干預(yù)前分別稱為O組和L組。每四周行一次口服糖耐量檢測(OGTT),36周齡時,將到達(dá)糖耐量受損期(IGT期)的26只OLETF大鼠,隨機(jī)分為兩組,一組行牙周炎造模,稱為復(fù)合組(O CP(+)組),另一組為糖尿病組(O CP(-)組)；LETO大鼠也隨機(jī)分為兩組,一組行牙周炎造模即牙周炎組(L CP(+)組),另一組為正常組(L CP(-)組)。 (2)采取絲線結(jié)扎和涂菌法建立實驗性牙周炎模型。將3.0絲線分別結(jié)扎于左、右上頜第一磨牙(molar1, M1)及第二磨牙(molar2, M2)牙頸部并盡量將結(jié)扎好的絲線壓入深牙周袋內(nèi),以完全沒入牙齦為準(zhǔn),將濃度為109CFU/ml的4種標(biāo)準(zhǔn)菌(牙齦卟啉單胞菌、伴放線嗜血桿菌、中間普氏菌、具核梭桿菌)混合懸液接種于齦溝內(nèi)。 (3)56周齡時,處死所有實驗大鼠,采集血清檢測大鼠血清胰島素水平；收集組織樣本,頜骨樣本進(jìn)行Micro-CT掃描,EDTA脫鈣后常規(guī)脫水包埋,切片行HE染色,觀察牙周炎癥狀態(tài)。 結(jié)果 (1)比較四組大鼠HOMA-IR值,O CP(+)組胰島素抵抗指數(shù)顯著高于O CP(-)組(t=-0.6058,p=0.000), LCP(-)組和L CP(+)組之間沒有顯著差異(t=1.721,P=0.107)。 (2)比較四組大鼠牙槽骨吸收體積,O CP(+)組與L CP(+)組牙槽骨骨喪失量明顯分別大于O CP(-)組和L CP(-)組,差別具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=4.296,P=0.013；t=5.963,P=0.004)。 (3)觀察四組大鼠牙周組織切片HE染色,L CP(-)組及O CP(-)組大鼠牙齦結(jié)合上皮附著緊密,牙齦和牙周膜膠原纖維排列有序,上皮下固有層極少量炎細(xì)胞浸潤。L CP(+)組和O CP(+)組大鼠牙齦上皮釘突變長,牙齦牙周膜膠原纖維排列紊亂、破壞,上皮下固由層大量炎細(xì)胞浸潤,O CP(+)組炎癥更重,上皮釘突甚至呈條索狀。 結(jié)論 (1)本實驗利用OLETF糖尿病大鼠模型,采用絲線結(jié)扎聯(lián)合涂菌法進(jìn)行牙周炎造模,成功建立了牙周炎復(fù)合II型糖尿病動物模型。 (2)本實驗結(jié)果提示單純牙周炎并不會引起大鼠胰島素抵抗,但是在T2DM狀態(tài)下,牙周炎通過加重機(jī)體的炎癥水平,加重胰島素抵抗程度。 第二章牙周炎對糖尿病大鼠胰腺組織形態(tài)的影響 目的 通過牙周炎復(fù)合糖尿病模型大鼠胰腺組織形態(tài)及相關(guān)代謝的觀察,初步探索牙周炎對糖尿病大鼠的組織病理學(xué)影響機(jī)制。 方法 胰腺組織固定后,常規(guī)脫水包埋,制成石蠟切片,分別行HE染色、MASSON染色和胰島素抗體免疫組化染色,在光學(xué)顯微鏡下觀察胰腺尤其是胰島的組織形態(tài)。 結(jié)果 (1)HE染色結(jié)果顯示, LCP(-)組和L CP(+)組大鼠胰島細(xì)胞成團(tuán)分布于外分泌腺中,胰島細(xì)胞胞核藍(lán)染,胞質(zhì)淡染,胰島與外分泌腺邊界清晰。相對于正常組大鼠,O CP(-)組大鼠胰島組織結(jié)構(gòu)出現(xiàn)異常,胰島細(xì)胞排列紊亂,與外分泌腺邊界不清。O CP(+)組大鼠胰島形態(tài)紊亂更重,有外分泌腺長入胰島,胰島被增生纖維分割,外分泌腺中出現(xiàn)脂肪異位沉積。 (2) MASSON染色結(jié)果顯示,L CP(-)組和L CP(+)組大鼠胰島內(nèi)幾乎沒有纖維組織,胰島外圍有菲薄的結(jié)締組織被膜包繞,與外分泌腺邊界清晰。O CP(-)組大鼠胰島內(nèi)纖維組織增多呈淡藍(lán)色,在外分泌腺也觀察到纖維成分增多。OCP(+)組大鼠胰島結(jié)構(gòu)紊亂,大量纖維組織機(jī)化替代正常胰島細(xì)胞,脂肪異位沉積。 (3)胰島素抗體免疫組化結(jié)果顯示,L CP(-)組和L CP(+)組大鼠胰島中大部分細(xì)胞為p細(xì)胞,而且分布在中央呈陽性表達(dá)強(qiáng),形狀規(guī)則。0CP(-)組大鼠p細(xì)胞細(xì)胞分布不規(guī)則,有彌散趨勢,陽性表達(dá)減弱。O CP(+)組大鼠胰島p細(xì)胞數(shù)量明顯減少,胰島內(nèi)出現(xiàn)纖維分隔。 結(jié)論 本實驗觀察結(jié)果提示在健康機(jī)體中,單純的慢性牙周炎并不會引起大鼠胰島組織形態(tài)的改變；但糖尿病機(jī)體內(nèi),牙周炎可能通過加重胰腺的病理改變,破壞胰島的正常分泌功能,從而加重糖尿病大鼠的代謝機(jī)能異常。 第三章牙周炎對糖尿病大鼠胰島細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 目的 通過檢測胰島細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2和Caspase-3的表達(dá),探索牙周炎對糖尿病大鼠胰島病變影響的可能凋亡機(jī)制。方法 大鼠胰腺行凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2和Caspase-3免疫組化染色,進(jìn)行半定量分析,比較四組大鼠胰島中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)量。結(jié)果 (1)Bax蛋白在O CP(+)組的表達(dá)比O CP(-)組強(qiáng),并且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=7.123,p=0.000).L CP(-)組和L CP(+)胰島中Bax蛋白表達(dá)很弱,兩組間沒有顯著差異(t=-1.022,P=0.324)。 (2)Bcl-2蛋白在L CP(+)組和L CP(-)組表達(dá)較其余兩組強(qiáng),但兩組間表達(dá)沒有統(tǒng)計學(xué)差異(t=1.814,P=0.091),O CP(+)組蛋白表達(dá)最弱,與O CP(-)組相比,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=-2,565,P=0.022)。 (3) Caspase-3蛋白在O CP(+)組表達(dá)強(qiáng)于O CP(-)組,兩組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=7.134,P=0.000)；在L CP(+)組和L CP(-)組表達(dá)都很弱,且兩組間表達(dá)沒有顯著差異(t=-0.190,P=0.852)。 結(jié)論 本實驗結(jié)果提示糖尿病狀態(tài)下,慢性牙周炎可能通過調(diào)控相關(guān)凋亡蛋白的表達(dá),影響促進(jìn)/抑制細(xì)胞凋亡的平衡,從而破壞機(jī)體的胰島相關(guān)功能,提示在糖尿病合并牙周炎狀態(tài)下,胰島細(xì)胞向促凋亡方向發(fā)展。
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【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R781.4;R587.1

【參考文獻(xiàn)】

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