【摘要】：研究目的人牙根尖乳頭干細(xì)胞(stem cells from the apical papilla,SCAPs),是一種來(lái)源于正在發(fā)育的牙根尖乳頭組織的間充質(zhì)干細(xì)胞,在年輕恒牙的牙根發(fā)育中發(fā)揮重要作用。間充質(zhì)干細(xì)胞具有免疫調(diào)控功能,那么SCAPs是否對(duì)免疫細(xì)胞有一定的調(diào)控作用,目前尚不清楚。單核巨噬細(xì)胞在免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用,被微生物及各種趨化因子活化可產(chǎn)生IL-6、TNF-a等炎性因子,從而導(dǎo)致炎癥的發(fā)生、發(fā)展。根據(jù)巨噬細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子和表型可將其分為兩種極化類型,即促進(jìn)炎癥發(fā)生的Ml型巨噬細(xì)胞和促進(jìn)組織修復(fù)的M2型巨噬細(xì)胞。有研究發(fā)現(xiàn),間充質(zhì)干細(xì)胞能夠抑制單核巨噬細(xì)胞的活化并促進(jìn)其向M2型極化從而達(dá)到免疫抑制的作用,本實(shí)驗(yàn)初步探討SCAPs對(duì)單核巨噬細(xì)胞活化和極化的免疫調(diào)控作用。實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果1.細(xì)胞培養(yǎng)(1)SCAPs的培養(yǎng):收集因正畸治療需要而拔除的未發(fā)育完全的健康第三磨牙,無(wú)菌分離根尖乳頭組織,采用酶消化法分離培養(yǎng)SCAPs。(2)單核細(xì)胞系THP-1、U937傳代培養(yǎng)。(3)人單核細(xì)胞源性巨噬細(xì)胞(Monocyte-derived macrophages,MDM):淋巴細(xì)胞分離管分離健康人的外周血獲得外周血單個(gè)核細(xì)胞(Peripheral blood mononuclear cells,PBMC),將PBMC細(xì)胞懸液置培養(yǎng)皿中過(guò)夜,其中的單核細(xì)胞可貼壁成巨噬細(xì)胞。2.SCAPs促進(jìn)單核細(xì)胞THP-1向M2樣巨噬細(xì)胞極化SCAPs與THP-1通過(guò)Transwell小室進(jìn)行共培養(yǎng),實(shí)驗(yàn)組為SCAPs+THP-1;對(duì)照組為THP-1。qPCR結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組THP-1中與Ml型巨噬細(xì)胞相關(guān)的TNF-α和IL-12在共培養(yǎng)1d時(shí)升高,其余時(shí)間點(diǎn)均呈下降趨勢(shì)(p0.5),與M2型巨噬細(xì)胞相關(guān)的IL-10、TGF-β1、CD163、CD206均升高(p0.5),僅CD206在共培養(yǎng)3d時(shí)有下降趨勢(shì);流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)共培養(yǎng)3d THP-1中TNF-α的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組的TNF-α表達(dá)顯著下降(p0.5),與qPCR結(jié)果一致;Western Blotting 檢測(cè)共培養(yǎng)后 THP-1 中 stat3/P-stat3、smad3/P-smad3 的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組P-stat3/stat3蛋白相對(duì)表達(dá)水平較對(duì)照組呈上升趨勢(shì)(p0.5)而P-smad3/smad3蛋白相對(duì)表達(dá)水平則未見(jiàn)明顯變化(p0.5),表明SCAPs促進(jìn)THP-1向M2樣巨噬細(xì)胞極化,可能與stat3通路的激活有關(guān)。3.SCAPs抑制PMA誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞中TNF-a的表達(dá)單核細(xì)胞系 THP-1、U937 通過(guò)佛波酯(Phorbol-12-myristate-13-acetate,PMA)誘導(dǎo)成巨噬細(xì)胞后與SCAPs共培養(yǎng),實(shí)驗(yàn)組為巨噬細(xì)胞+SCAPs;對(duì)照組為巨噬細(xì)胞。qPCR檢測(cè)共培養(yǎng)后巨噬細(xì)胞樣THP-1中炎性因子和表面標(biāo)志物的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組TNF-α的表達(dá)顯著下降(p0.5),而與極化相關(guān)的其他分子則無(wú)明顯變化,僅IL-10、CD163在共培養(yǎng)的初期較對(duì)照組升高(p0.5),實(shí)驗(yàn)組巨噬細(xì)胞樣U937中TNF-α的表達(dá)也顯著下降(p0.5)。通過(guò)ELISA檢測(cè)共培養(yǎng)上清中的TNF-α的表達(dá)量,發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組上清中TNF-α的表達(dá)下降(p0.5),進(jìn)一步證實(shí)與SCAPs共培養(yǎng)后,巨噬細(xì)胞樣THP-1和巨噬細(xì)胞樣U937分泌的TNF-α降低,表明SCAPs對(duì)PMA誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞極化作用不明顯,卻對(duì)TNF-α抑制作用明顯增強(qiáng)。4.SCAPs上清抑制人單核細(xì)胞源性巨噬細(xì)胞的活化PBMC中的單核細(xì)胞貼壁成巨噬細(xì)胞后棄上清,加適量的SCAPs條件培養(yǎng)液培養(yǎng)4d,實(shí)驗(yàn)組為SCAPs條件培養(yǎng)液+MDM;對(duì)照組為α-MEM培養(yǎng)液+MDM。通過(guò)qPCR檢測(cè)MDM炎性因子表達(dá)情況,實(shí)驗(yàn)組TNF-α、IL-12、IL-6、IL-Iβ的表達(dá)均較對(duì)照組降低(p0.5),而實(shí)驗(yàn)組IL-10、TGF-β1的表達(dá)無(wú)明顯變化(p0.5),說(shuō)明SCAPs上清可以抑制MDM的活化。結(jié)論通過(guò)共培養(yǎng),SCAPs可以促進(jìn)單核細(xì)胞THP-1向M2樣巨噬細(xì)胞極化,且stat3通路的激活可能參與其中;SCAPs對(duì)PMA誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞樣THP-1的極化作用不明顯,卻可以顯著抑制巨噬細(xì)胞樣THP-1、U937中TNF-α的表達(dá);SCAPs上清能夠抑制人單核細(xì)胞源性巨噬細(xì)胞的活化。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R781

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本文編號(hào)：2407440