【摘要】：牙髓干細(xì)胞(Dental Pulp Stem Cells DPSCs)這一概念最早是由Shi S和Gronthos S在2000年提出，其與成骨細(xì)胞類似為間充質(zhì)細(xì)胞來(lái)源，被認(rèn)為是成熟牙髓組織的前體，在生理或病理狀態(tài)下能夠分化為成牙本質(zhì)細(xì)胞，進(jìn)而形成修復(fù)性牙本質(zhì)。同大多數(shù)干細(xì)胞一樣，牙髓干細(xì)胞在體外培養(yǎng)的過(guò)程中也會(huì)發(fā)生自分化，逐漸失去自我更新的能力。因此作為牙組織工程中種子細(xì)胞的重要來(lái)源，使得其在體外培養(yǎng)的過(guò)程中保持干性避免自分化是亟待解決的問(wèn)題。 Notch信號(hào)通路調(diào)控著細(xì)胞間的分化、增殖和凋亡。其最基本也是最重要的作用體現(xiàn)在其介導(dǎo)的側(cè)抑制作用使細(xì)胞分化相關(guān)的特異性基因表達(dá)受阻，從而使得細(xì)胞處于較原始的未分化狀態(tài)。因此有學(xué)者提出利用Notch通路的“分化抑制作用”使得干細(xì)胞在體外培養(yǎng)的過(guò)程中保持自我更新能力。利用這一理念，通過(guò)在造血干細(xì)胞中過(guò)表達(dá)Notch受體，使得造血干細(xì)胞在體外培養(yǎng)成功獲得了“永生”。 相鄰細(xì)胞間位于胞膜上的Notch配體和受體結(jié)合，從而暴露出Notch1的胞內(nèi)段NICD（Notch intracellular domain），活化的NICD轉(zhuǎn)移至胞核內(nèi)將激活Notch通路的靶基因，從而激活Notch信號(hào)。已有學(xué)者證實(shí)外源性NICD能夠激活細(xì)胞內(nèi)Notch通路下游的基因，其對(duì)靶基因的調(diào)控與Notch配體和受體結(jié)合后所誘導(dǎo)的Notch信號(hào)激活途徑一致。因此在細(xì)胞內(nèi)過(guò)表達(dá)NICD，來(lái)模擬Notch途徑上調(diào)的過(guò)程被廣泛應(yīng)用于Notch通路的研究中。本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)慢病毒載體介導(dǎo)的NICD轉(zhuǎn)染人的DPSCs，上調(diào)DPSCs中NICD的表達(dá)，探究其對(duì)DPSCs增殖和分化的影響，并初步探討Notch通路對(duì)DPSCs增殖和分化的作用機(jī)制。 目的：構(gòu)建穩(wěn)定過(guò)表達(dá)NICD的牙髓干細(xì)胞；觀察過(guò)表達(dá)NICD對(duì)牙髓干細(xì)胞增殖分化的影響；初步研究Notch通路對(duì)DPSCs增殖和分化的作用機(jī)制。 方法： 1.穩(wěn)定過(guò)表達(dá)NICD的牙髓干細(xì)胞的建立：復(fù)蘇前期實(shí)驗(yàn)組的原代人牙髓干細(xì)胞，鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，確定細(xì)胞活性良好；轉(zhuǎn)染外源性的過(guò)表達(dá)NICD的慢病毒載體，使用嘌呤霉素篩選穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株，western blot技術(shù)和RT-PCR技術(shù)驗(yàn)證轉(zhuǎn)染后NICD表達(dá)水平上升，細(xì)胞免疫熒光技術(shù)觀察NICD表達(dá)量及其表達(dá)位置的改變。實(shí)驗(yàn)分為DPSCs/NICD組、DPSCs/vector組、DPSCs/wt組。 2.觀察過(guò)表達(dá)NICD后對(duì)牙髓干細(xì)胞增殖、遷移和分化的影響：通過(guò)CCK-8法和流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)S期的改變，觀察外源性NICD對(duì)牙髓干細(xì)胞增殖的影響；誘導(dǎo)細(xì)胞分化并通過(guò)western blot技術(shù)檢測(cè)牙髓干細(xì)胞分化的特異性蛋白DSPP的表達(dá)；Transwell檢測(cè)三組細(xì)胞遷移能力的強(qiáng)弱。實(shí)驗(yàn)分組同上。 3.過(guò)表達(dá)NICD對(duì)DPSCs增殖和分化的作用機(jī)制研究：western blot技術(shù)和qRT-PCR技術(shù)觀察Hes1、Runx2的表達(dá)改變，實(shí)驗(yàn)分為DPSCs/NICD組、DPSCs/vector組。通過(guò)siRNA-Hes1，觀察抑制Hes1表達(dá)后，Runx2和DSPP的表達(dá)變化，探討Notch通路調(diào)節(jié)DPSCs增殖和分化的作用機(jī)制。實(shí)驗(yàn)分組：DPSCs/vector組、DPSCs/NICD組、DPSCs/vector/siRNA-Hes1和DPSCs/NICD/siRNA-Hes1。 結(jié)果： 1.成功建立穩(wěn)定過(guò)表達(dá)NICD的牙髓干細(xì)胞，NICD在DPSCs/NICD組的表達(dá)明顯高于DPSCs/vector組和DPSCs/wt組，并且加速其核內(nèi)表達(dá)，而后兩者之間的表達(dá)沒(méi)有顯著差異。 2.相對(duì)于DPSCs/vector組和DPSCs/wt組，DPSCs/NICD組的增殖能力明顯增強(qiáng)，S期比例上升，DSPP表達(dá)顯著下調(diào)，細(xì)胞遷移能力明顯增強(qiáng)，而前兩組之間未見(jiàn)明顯差異。 3.過(guò)表達(dá)NICD后，DPSCs/NICD組的Hes1表達(dá)明顯上調(diào)，Runx2的表達(dá)明顯下調(diào)，與DPSCs/vector組相比較均有顯著性差異。siRNA-Hes1后，與對(duì)照組相比較，各組Hes1的mRNA和蛋白表達(dá)均有不同程度的下調(diào)，，其中，DPSCs/vector/siRNA-Hes1組表達(dá)下調(diào)最為顯著，與DPSCs/NICD組相比有顯著性差異；siRNA-Hes1后，Runx2和DSPP的mRNA和蛋白表達(dá)均稱上升趨勢(shì)，各組與對(duì)照組相比較均有顯著性差異，其中，與DPSCs/vector組相比較，DPSCs/vector/siRNA-Hes1組的Runx2和DSPP表達(dá)上調(diào)最為明顯。結(jié)果顯示，Runx2與DSPP表達(dá)呈正相關(guān)。 結(jié)論： 1.轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)NICD的慢病毒顆粒后，NICD可在體外培養(yǎng)的DPSCs中呈穩(wěn)定性的高表達(dá)。 2.過(guò)表達(dá)的NICD促進(jìn)牙髓干細(xì)胞的增殖和遷移，抑制了牙髓干細(xì)胞的成牙本質(zhì)分化。 3.過(guò)表達(dá)NICD后，促進(jìn)DPSCs中Notch通路靶基因Hes1的表達(dá)并抑制Runx2的活性，從而抑制DSPP的表達(dá)以及DPSCs的分化；抑制Hes1的活性上調(diào)Runx2和DSPP的表達(dá)，促進(jìn)DPSCs向成牙本質(zhì)細(xì)胞的分化。
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【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R781.3

【參考文獻(xiàn)】

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1 郭紅延,吳補(bǔ)領(lǐng),郭希民,楊成,徐蓬,王常勇;重建牙本質(zhì)-牙髓復(fù)合體樣結(jié)構(gòu)的實(shí)驗(yàn)研究[J];中華口腔醫(yī)學(xué)雜志;2005年06期

本文編號(hào)：2396738