【摘要】：目的:口腔鱗狀細胞癌(Oral Squamous Cell Carcinoma,OSCC)是頭頸部最常見的惡性腫瘤之一,發(fā)病率高,嚴(yán)重威脅人類健康。目前有關(guān)OSCC的發(fā)病機制尚不清楚;有研究表明分化抑制因子-1(Id1)和核轉(zhuǎn)錄因子kappa B(NF-κB)在口腔鱗狀細胞癌(OSCC)中均高表達,本研究為探討Id1和NF-κB亞單位P65在OSCC發(fā)病機制中是否起著協(xié)同作用。方法:1.收集新鮮的OSCC臨床標(biāo)本和對應(yīng)的癌旁組織標(biāo)本。2.常規(guī)方法分離和提取鱗癌細胞,原代細胞培養(yǎng)、傳代。3.RT-PCR與Western blot檢測OSCC細胞中CD133與BMI-1的m RNA及其蛋白的表達情況。4.用FACS流式細胞儀和MACS細胞儀來分選出CD133+BMI-1+細胞并進行培養(yǎng)。5.構(gòu)建Id1和P65基因的載體。6.用高效電轉(zhuǎn)染辦法分別將Id1和P65載體(單獨或同時)轉(zhuǎn)染CA9-22與HOK16B細胞株細胞,并檢測其轉(zhuǎn)染后細胞中CD133、BMI-1的表達變化。7.分別將CD133+BMI-1+細胞的CA9-22、HOK16B及OSCC細胞按不同的細胞數(shù)分別接種到SCID小鼠,觀察異種移植瘤的生長情況。結(jié)果:1.在OSCC原代培養(yǎng)的細胞中表達CD133和BMI-1 m RNA及其蛋白,并可見到OSCC單個細胞同時表達CD133和BMI-1;2.成功分選出CD133和BMI-1雙陽性的原代OSCC細胞;3.成功構(gòu)建了Id1和P65基因載體;4.在培養(yǎng)的CA9-22細胞中,單獨轉(zhuǎn)染Id1或p65后,無法檢測到BMI-1蛋白的表達;如同時轉(zhuǎn)染Id1和p65后,可檢測到細胞中CD133、Bmi-1、Cdc2與CD1.的表達明顯上調(diào),而這種協(xié)同性上調(diào)表達可被CD1抑制劑arginine vasopressin、Cdc2抑制劑catharidic aci以及蛋白抑制劑Cycloheximide所阻斷;在空載體轉(zhuǎn)染的細胞中無法檢測到Bmi-1,、Cdc2與CD1的表達;但當(dāng)轉(zhuǎn)染Id1,p65,或Id1+p65后,細胞均明顯表達CD1335.CA9-22細胞轉(zhuǎn)染Id1和p65后,明顯影響細胞周期的進程,促進細胞增殖;6.在分別接種10,000個和100,000個CD133和BMI-1雙陽性細胞(來自CA9-22、HOK16B及OSCC提取的細胞)的SCID裸鼠組中,CD133和BMI-1雙陽性癌細胞能引發(fā)異種移植瘤的生長。結(jié)論:1.OSCC新鮮標(biāo)本中含有CD133和BMI-1雙陽性細胞亞群。2.Id1和NF-κB亞單位p65可能通過Cyclin D1和Cdc2信號通路,上調(diào)CA9-22細胞中的CD133與BMI-1表達,促進了細胞的增殖。3.CD133和BMI-1雙陽性細胞可以啟動異種移植瘤的生長。4.Id1和NF-κB亞單位p65在OSCC發(fā)病中可能起著一定的協(xié)同作用。
[Abstract]:Objective: oral squamous cell carcinoma (Oral Squamous Cell Carcinoma,OSCC) is one of the most common malignant tumors in head and neck. At present, the pathogenesis of OSCC is not clear. It has been shown that both differentiation suppressor 1 (Id1) and nuclear transcription factor kappa B (NF- 魏 B are highly expressed in oral squamous cell carcinoma (OSCC) (OSCC). This study was designed to investigate whether Id1 and NF- 魏 B subunit p65 play a synergistic role in the pathogenesis of OSCC. Methods: 1. Collect fresh OSCC clinical specimens and corresponding paracancerous tissues. 2. Squamous cell carcinoma cells were isolated and extracted by routine method. The primary cells were cultured. The expression of m RNA and its protein of CD133 and BMI-1 in OSCC cells was detected by 3.RT-PCR and Western blot. 4. CD133 BMI-1 cells were isolated and cultured by FACS flow cytometry and MACS cell analyzer. Construction of Id1 and p65 gene vector. Id1 and p65 vectors were transfected into CA9-22 and HOK16B cells by high efficiency electrotransfection, respectively. The expression of CD133,BMI-1 was detected after transfection. 7. The CA9-22,HOK16B and OSCC cells of CD133 BMI-1 cells were inoculated into SCID mice according to different cell numbers to observe the growth of xenografts. Results: 1. CD133 and BMI-1 m RNA and their proteins were expressed in OSCC primary cultured cells, and OSCC cells expressed CD133 and BMI-1;2. at the same time. The primary OSCC cells which were both positive for CD133 and BMI-1 were successfully selected. Id1 and p65 gene vectors were constructed successfully. In cultured CA9-22 cells, the expression of BMI-1 protein could not be detected after transfection of Id1 or p65 alone, and CD133,Bmi-1,Cdc2 and CD1. could be detected after transfection of Id1 and p65 at the same time. The expression of Bmi-1,,Cdc2 and CD1 could not be detected in empty vector transfected cells, but the expression of Bmi-1,,Cdc2 and CD1 could be blocked by arginine vasopressin,Cdc2 inhibitor catharidic aci and protein inhibitor Cycloheximide, and the expression of Bmi-1,,Cdc2 and CD1 could not be detected in empty vector transfected cells. However, after transfection of Id1,p65, or Id1 p65, the cells expressed CD1335.CA9-22 cells transfected with Id1 and p65, which significantly affected the progress of cell cycle and promoted cell proliferation. 6. In SCID nude mice inoculated with 10 000 and 100000 CD133 and BMI-1 double positive cells (from cells extracted from CA9-22,HOK16B and OSCC) CD133 and BMI-1 double positive cells could induce the growth of xenografts. Conclusion: there are double positive subsets of CD133 and BMI-1 in fresh 1.OSCC. 2.Id1 and NF- 魏 B subunit p65 may up-regulate the expression of CD133 and BMI-1 in CA9-22 cells through Cyclin D1 and Cdc2 signaling pathway. 3.CD133 and BMI-1 double positive cells could initiate the growth of xenografts. 4.Id1 and NF- 魏 B subunit p65 might play a synergistic role in the pathogenesis of OSCC.
【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R739.85

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本文編號：2376773