【摘要】：研究背景 牙周炎是一種侵犯牙周支持組織的炎癥性和破壞性疾病,其主要特征為牙齦及牙周膜膠原纖維溶解破壞,牙周附著喪失,牙槽骨吸收,最終導(dǎo)致牙齒松動(dòng)脫落,跟癌癥和心血管疾病一樣嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康,因此明確各種宿主因素在牙周炎發(fā)生發(fā)展過(guò)程中所扮演的角色,對(duì)了解牙周炎病因及病理生理機(jī)制就顯得尤為重要。 牙周炎的發(fā)病機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜,是近年來(lái)學(xué)者深入研究探討的課題之一,細(xì)菌是牙周炎的始動(dòng)因素,除全身易感因素外,細(xì)胞因子的作用不容忽視。學(xué)者認(rèn)為牙周炎主要是通過(guò)致病因子引發(fā)的宿主免疫和炎癥反應(yīng)失調(diào)所造成的間接損害。多種炎性因子形成細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò),大多參與牙槽骨破骨與成骨、牙周組織破壞與修復(fù)過(guò)程。其中在破骨前體細(xì)胞分化成成熟破骨細(xì)胞過(guò)程中,促進(jìn)破骨細(xì)胞分化的有白細(xì)胞介素1β (Interleukin-1β, IL-1β)、腫瘤壞死因子α (Tumor necrosis factor-a, TNF-α)、IL-17和抑制破骨細(xì)胞分化促進(jìn)成骨的IL-10、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(Transforming growth factor, TGF-P)等。 白細(xì)胞介素1(IL-1)主要由單核-吞噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞等誘導(dǎo)產(chǎn)生,具有促炎功能,可分解、代謝、促進(jìn)前列腺素E2合成,激活破骨細(xì)胞,促進(jìn)破骨細(xì)胞合成導(dǎo)致骨吸收。并可促進(jìn)體質(zhì)內(nèi)的間質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生金屬蛋白酶,導(dǎo)致基質(zhì)中的膠原降解、破壞。有研究表明,在炎癥部位的齦溝液中,IL-1活性明顯高于健康部位,IL-1的量也與牙周袋的深度呈正相關(guān)關(guān)系。其中齦溝液中IL-1p的水平與慢性牙周炎的嚴(yán)重程度密切相關(guān)。IL-1p是一種多效性細(xì)胞因子,具有廣泛的細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)作用,包括促進(jìn)胸腺細(xì)胞和T細(xì)胞增殖和分化,刺激破骨細(xì)胞和膠原酶,促進(jìn)破骨細(xì)胞形成和骨吸收,最終導(dǎo)致骨和牙周結(jié)締組織破壞,牙周組織修復(fù)能力喪失等。 TNF-α主要由被G-細(xì)菌脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)激活的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生,對(duì)白細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞及結(jié)締組織中多種細(xì)胞具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng),并可活化前破骨細(xì)胞使之分化成熟為破骨細(xì)胞,促進(jìn)骨吸收,還可增強(qiáng)血管通透性,具有促炎作用。 IL-8是中性粒白細(xì)胞強(qiáng)有力的趨化因子,可聚集并激活中性白細(xì)胞,使其釋放溶菌酶,Gamonal等研究發(fā)現(xiàn),IL-8在正常牙齦組織和牙周炎患者牙齦組織中均有表達(dá),但在病變牙齦組織中明顯高于正常牙齦組織,且經(jīng)治療后顯著下降。并有研究發(fā)現(xiàn)IL-8可以刺激RANKL mRNA表達(dá)和破骨細(xì)胞生成,促進(jìn)骨吸收。 IL-17作為一種促炎癥性細(xì)胞因子,可以與受體特異性結(jié)合,有促進(jìn)炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答、造血等多種作用。并可刺激成纖維細(xì)胞釋放IL-6、IL-8、前列素E2(Prostaglandin E2, PGE2)等,誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-1β、TNF-α等,抑制IL-10的生成,促進(jìn)骨吸收。 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)是一種多功能的細(xì)胞活性調(diào)節(jié)因子,具有調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)功能,與組織修復(fù)密切相關(guān)。在慢性牙周炎發(fā)生發(fā)展過(guò)程中,TGF-β參與了牙周組織炎癥的免疫反應(yīng)和軟硬組織的再生修復(fù),影響著牙周疾病的發(fā)展速度和愈合過(guò)程。 Asporin (ASPN)也叫牙周膜相關(guān)蛋白(periodontal ligament associated protein1, PLAP1),是小富亮氨酸重復(fù)序列蛋白多糖(small leucine-rich proteoglycans, SLRPs)家族中的一員,此家族成員還有二聚糖(Biglycan),核心聚糖(Decorin),fibromodulin, lumican等。SLRPs可以和許多不同的細(xì)胞因子、表面受體、生長(zhǎng)因子結(jié)合達(dá)到調(diào)節(jié)細(xì)胞的功能。如Toll樣受體、TGF-β、骨形成蛋白(Bone morphogenetic protein-4, BMP-4)等�，F(xiàn)有的研究表明SLRPs在調(diào)節(jié)膠原纖維的形成,組裝和降解過(guò)程中扮演著重要角色。SLRPs與膠原纖維和彈性纖維結(jié)合,可以增強(qiáng)纖維的穩(wěn)定性,保護(hù)纖維不被各種膠原酶降解。 Asporin是2001年發(fā)現(xiàn)的SLRPs家族新成員,與其他成員一樣它具有亮氨酸重復(fù)序列,不同的是Asporin不是嚴(yán)格意義的蛋白多糖,其氨基末端有個(gè)獨(dú)特的天門(mén)冬氨酸殘基重復(fù)區(qū)域,Loughlin J發(fā)現(xiàn)Asporin天門(mén)冬氨酸殘基量D14等位基因與骨關(guān)節(jié)炎易感性顯著相關(guān)。Sebastian K等對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用研究結(jié)果顯示Asporin與Decorin相互競(jìng)爭(zhēng),直接影響成骨細(xì)胞膠原礦化。Kei等報(bào)道Asporin在骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制中抑制TGF-β成軟骨和骨重構(gòu)功能,從而抑制成骨。Yamada等報(bào)道Asporin對(duì)牙周組織中的膠原纖維同樣發(fā)揮著調(diào)節(jié)作用,并且抑制BMP-2的活性從而抑制成骨。然而Wang L等報(bào)道Asporin促進(jìn)鈣離子結(jié)合參與礦化過(guò)程,并能影響羥基磷灰石晶體形成。促進(jìn)成骨細(xì)胞膠原礦化。Eun-hyang Lee等用免疫組化的方法研究發(fā)現(xiàn)Asporin在前期牙本質(zhì)和牙本質(zhì)界高表達(dá),并且人牙髓干細(xì)胞礦化早期高表達(dá),后期低表達(dá),從而表明Asporin在人牙髓干細(xì)胞礦化過(guò)程中起重要作用。 Asporin在骨關(guān)節(jié)炎的軟骨中高表達(dá)并呈多態(tài)性表達(dá),在抑制成骨的機(jī)制中會(huì)不會(huì)有炎性細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)作用呢?Elise Duval等在骨關(guān)節(jié)炎的細(xì)胞中檢測(cè)細(xì)胞因子對(duì)Asporin表達(dá)的調(diào)節(jié)作用,結(jié)果顯示IL-1p和TNF-a下調(diào)Asporin的表達(dá)而TGF-β上調(diào)Asporin的表達(dá)。 目前Asporin已證實(shí)在正常牙周組織中高表達(dá),在牙周炎牙周組織中表達(dá)是否有變化尚未見(jiàn)報(bào)道,Asporin是否參與了牙周炎的致病過(guò)程?如何行使其功能?牙周炎致病機(jī)制中的重要細(xì)胞因子在牙周膜細(xì)胞中是否對(duì)Asporin表達(dá)有調(diào)節(jié)作用?本課題通過(guò)檢鋇IL-1β, TNF-α, TGF-β, IL-17, IL-8等炎性因子對(duì)牙周膜細(xì)胞表達(dá)Asporin的影響,探索Asporin在牙周炎的發(fā)生及發(fā)展過(guò)程中所扮演的角色。 本論文分為以下三部分內(nèi)容 第一部分hPDLCs的分離培養(yǎng)與鑒定 通過(guò)收集臨床新鮮拔除的健康智齒或正畸需要拔除的前磨牙,刮取根中牙周膜組織,利用組織塊預(yù)消化法法分離培養(yǎng)hPDLCs,通過(guò)檢測(cè)其生長(zhǎng)曲線(xiàn),礦化能力,膠原表達(dá)情況以及流式細(xì)胞鑒定間充質(zhì)表面標(biāo)記物,證實(shí)為牙周膜細(xì)胞,為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供了可靠的細(xì)胞來(lái)源。 第二部分Asporin在牙周組織中的表達(dá) 通過(guò)臨床收集健康人牙周組織,利用免疫組織化學(xué)方法檢鋇Asporin在牙周組織中的表達(dá)。并利用RT-PCR檢鋇Asporin在hPDLCs中的表達(dá),用免疫細(xì)胞化學(xué)方法對(duì)其進(jìn)行定位,為后續(xù)實(shí)驗(yàn)建立基礎(chǔ)。 第三部分炎性因子對(duì)hPDLCs表達(dá)Asporin的影響 通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)分別用0.5ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL的IL-1β, TNF-α, TGF-β, IL-17, IL-8誘導(dǎo)hPDLCs后Asporin的表達(dá)情況。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選定各炎性因子的濃度,并通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)各炎性因子誘導(dǎo)hPDLCs3,6,24,48h后Asporin的表達(dá),采用免疫細(xì)胞化學(xué)和western blot方法檢測(cè)其蛋白水平的變化,探索Asporin在牙周炎的發(fā)生及發(fā)展過(guò)程中起怎樣的調(diào)節(jié)作用。 材料與方法hPDLCs的分離培養(yǎng) 收集臨床新鮮拔除智齒或正畸需要拔除的前磨牙,年齡25歲以下,無(wú)齲壞及牙周炎癥感染,放入DMEM培養(yǎng)基中4℃保存,4h內(nèi)用組織塊酶消化法進(jìn)行體外培養(yǎng)。無(wú)菌PBS液沖洗三次,刮取牙根中1/3處牙周膜,PBS液沖洗三次后剪碎,0.2%I型膠原酶消化10min,完全培養(yǎng)基洗滌組織塊,離心,將組織塊均勻接種在培養(yǎng)瓶的培養(yǎng)面上,置于37℃5%CO2的孵箱中培養(yǎng)24h后,加入完全培養(yǎng)基覆蓋組織塊,繼續(xù)培養(yǎng)。細(xì)胞生長(zhǎng)至培養(yǎng)底面的80%后,以1：3的比例傳代擴(kuò)大培養(yǎng),第三到五代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。 MTT 將三到五代hPDLCs以2×103/孔的密度接種于96孔板,每次5個(gè)重復(fù)孔,1-8d每天同一時(shí)間M酶標(biāo)儀測(cè)定490nm波長(zhǎng)下各孔OD值,統(tǒng)計(jì)分析并作生長(zhǎng)曲線(xiàn)圖。 RT-PCR 提取細(xì)胞總RNA,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后,進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增、電泳顯影、紫外線(xiàn)拍照。 茜素紅染色 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞,礦化誘導(dǎo)14d后,4%多聚甲醛固定20min,茜素紅染色10min。倒置顯微鏡下觀察礦化結(jié)節(jié)形成情況。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)記物 取第3代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞,消化,1×105個(gè)細(xì)胞重懸于含有0.1%BSA冰的PBS緩沖液中,用CD2、CD44、CD90、CD105抗體冰上避光孵育1h,用含有0.1%BSA預(yù)冷的PBS清洗,流式細(xì)胞儀檢測(cè)標(biāo)記物陽(yáng)性率。 免疫組織化學(xué) 臨床收集健康牙周組織,4%多聚甲醛固定,石蠟包埋,切片,常規(guī)脫蠟至水,抗原修復(fù),血清封閉,Asporin一抗、二抗室溫孵育,DAB顯色,蘇木素復(fù)染,乙醇梯度脫水,二甲苯透明,中性樹(shù)膠封片。正置顯微鏡拍照。 qRT-PCR 使用Trizol提取牙周膜細(xì)胞的總RNA,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后,采用SYBR green法進(jìn)行熒光定量實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增,通過(guò)相對(duì)定量法計(jì)算2-ddCt值,檢測(cè)基因的相對(duì)表達(dá)情況。 免疫細(xì)胞化學(xué) 多聚甲醛固定細(xì)胞,0.2%Triton X-100室溫孵育,正常山羊血清室溫封閉,Asporin一抗、二抗室溫孵育,DAB顯色,蘇木素復(fù)染,乙醇梯度脫水,二甲苯透明,中性樹(shù)膠封片。正置顯微鏡拍照。Image-Pro Plus (IPP)軟件測(cè)其density(IOD/area)值。 Western blot 蛋白裂解液獲取細(xì)胞總蛋白,BCA法測(cè)定蛋白濃度,SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、抗體孵育、顯影及定影。 結(jié)果 1.本實(shí)驗(yàn)利用組織塊酶消化法成功分離培養(yǎng)hPDLCs,培養(yǎng)的細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形,其生長(zhǎng)曲線(xiàn)圖符合細(xì)胞生長(zhǎng)規(guī)律,具有成骨能力,Ⅰ型膠原表達(dá)陽(yáng)性、Ⅳ型膠原表達(dá)弱陽(yáng)性,取材于牙周膜組織,認(rèn)定為hPDLCs。 2.免疫組織化學(xué)和免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示Asporin高表達(dá)于人牙周組織和hPDLCs中,其主要定位于細(xì)胞胞質(zhì)中,胞核中未見(jiàn)表達(dá) 3. qRT-PCR結(jié)果顯示1ng/mL的TNF-α10ng/mL的IL-1β、5ng/mL的IL-17和IL-8能最大程度下調(diào)Asporin的表達(dá)(P0.01),5ng/mL的TGF-β最大程度上升Asporin的表達(dá)(P0.01)。 4. qRT-PCR、免疫細(xì)胞化學(xué)、Western blot結(jié)果顯示1ng/mL的TNF-α、l0ng/mL的IL-1β、5ng/mL的IL-17誘導(dǎo)24、48h后Asporin表達(dá)明顯下降,5ng/mL的IL-8誘導(dǎo)48h后Asporin表達(dá)明顯下降,5ng/mL的TGF-p誘導(dǎo)24h后Asporin表達(dá)明顯上升。 結(jié)論 1.利用組織塊預(yù)消化培養(yǎng)法成功分離培養(yǎng)hPDLCs,所獲細(xì)胞符合牙周膜來(lái)源細(xì)胞特性,證實(shí)為hPDLCs。 2. Asporin高表達(dá)于牙周組織以及牙周膜細(xì)胞中,定位于hPDLCs胞質(zhì)中。 3.促炎性細(xì)胞因子IL-1β, TNF-a, IL-17, IL-8均能抑制hPDLCs Asporin的表達(dá),抗炎性因子TGF-p促進(jìn)hPDLCs Asporin的表達(dá)。 4.推測(cè)Asporin參與牙周炎致病與修復(fù)過(guò)程,可能通過(guò)炎性因子下調(diào)牙周膜細(xì)胞中Asporin的表達(dá),從而抑制其促進(jìn)成骨細(xì)胞膠原礦化的能力,加速牙周炎的病理發(fā)展,抑制損傷的修復(fù)。相反,抗炎因子促進(jìn)Asporin的表達(dá),抑制牙周炎致病過(guò)程,促進(jìn)其修復(fù)。但具體調(diào)控機(jī)制還需進(jìn)一步研究。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R781.42

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2331100