【摘要】：種子細(xì)胞是組織工程研究與應(yīng)用中最為關(guān)鍵的要素之一，是組織工程化組織能夠再生的首要物質(zhì)基礎(chǔ)。目前研究所用的種子細(xì)胞從來(lái)源上可以劃分為自體細(xì)胞、同種異體細(xì)胞和異種細(xì)胞。從分化程度上可以劃分為胚胎干細(xì)胞、成體干細(xì)胞、定向祖細(xì)胞和分化成熟細(xì)胞。同種異體細(xì)胞和異種細(xì)胞雖然來(lái)源較為廣泛，但存在免疫排斥和細(xì)胞功能差異等問(wèn)題，胚胎干細(xì)胞則很難獲得定向分化純度較高的種子細(xì)胞，而且還存在倫理問(wèn)題，因此目前真正用于組織工程化組織構(gòu)建與組織缺損修復(fù)的種子細(xì)胞仍然是以自體來(lái)源的干細(xì)胞為主。作為組織工程種子細(xì)胞應(yīng)滿(mǎn)足如下幾點(diǎn)要求：體外擴(kuò)增能力強(qiáng)，能進(jìn)行大規(guī)模的擴(kuò)增；活力和功能良好，具備構(gòu)建組織的特定生物學(xué)性能；細(xì)胞純度高，具備特定的生物學(xué)功能的細(xì)胞占主導(dǎo)；不發(fā)生免疫排斥反應(yīng)；生物安全性好。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞恰恰符合上述要求，并且其來(lái)源廣泛，數(shù)量充足，體內(nèi)可再生；取材安全方便，供區(qū)創(chuàng)傷較��；細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)簡(jiǎn)單易行。但組織工程應(yīng)用時(shí)所需要的種子細(xì)胞是大量的，單純的體外擴(kuò)增培養(yǎng)很難在有限時(shí)間內(nèi)擴(kuò)增出所需要的量，于是，尋找可以高效體外擴(kuò)增骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的方法勢(shì)在必行。目前的研究顯示，特定序列的寡核苷酸(Oligonucleotide，ODN)對(duì)人牙周膜細(xì)胞、大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、牙齦卟啉單胞菌感染成骨細(xì)胞和MG63細(xì)胞的增殖具有顯著的促進(jìn)作用。故我們建立了“一定濃度的特定序列寡核苷酸可能促進(jìn)hBMSCs的增殖”這樣一個(gè)科學(xué)假設(shè)，篩選出對(duì)hBMSCs的增殖具有促進(jìn)作用的ODN，為ODN的應(yīng)用提供理論參考和為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)分為如下三個(gè)部分： 第一部分.hBMSCs的分離、培養(yǎng)及鑒定 密度梯度離心法獲取健康成人hBMSCs，觀察其細(xì)胞形態(tài)，，取第3代hBMSCs以1.0×104/cm2的密度接種于6孔板，分別加入成骨、成脂和成軟骨誘導(dǎo)液，每72h換液，2-3周后分別進(jìn)行茜素紅、油紅O和甲苯胺藍(lán)染色，干細(xì)胞表面分子的流式細(xì)胞儀鑒定。 第二部分.hBMSCs最佳鋪板濃度的確定 將第3代hBMSCs分別以3.0×103/cm2、6.0×103/cm2、1.2×104/cm2、2.4×104/cm2的濃度接種于96孔板，每孔200ul完全培養(yǎng)基，第4天換液，酶標(biāo)儀檢測(cè)CCK-8（測(cè)定波長(zhǎng)450nm，參比波長(zhǎng)630nm）光密度值，連續(xù)檢測(cè)7天，觀察生長(zhǎng)曲線(xiàn)，確立最佳鋪板密度。 第三部分.ODN saf5、FC003、MT01對(duì)hBMSCs增殖的影響 將第3代hBMSCs以最佳鋪板密度接種于96孔板，每孔200ul完全培養(yǎng)基，依據(jù)ODN種類(lèi)（MT01、FC003、Sa05f）和終濃度（0.5mg/L，1.0mg/L，2.0mg/L，4.0mg/L）分為12個(gè)實(shí)驗(yàn)組，每組4復(fù)孔，對(duì)照組加入等量PBS，酶標(biāo)儀檢測(cè)CCK-8（測(cè)定波長(zhǎng)450nm，參比波長(zhǎng)630nm）光密度值，連續(xù)檢測(cè)3天，確立對(duì)hBMSCs增殖有影響的ODN。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下： 第一部分 密度梯度離心法分離培養(yǎng)純化的細(xì)胞生長(zhǎng)良好，第3代hBMSCs單個(gè)成紡錘形，大量增殖后呈旋渦狀排列;成骨誘導(dǎo)21天后，培養(yǎng)皿中固定細(xì)胞后茜素紅染色，可見(jiàn)大量橘紅色的礦化結(jié)節(jié)；成脂誘導(dǎo)15天后，培養(yǎng)皿中固定細(xì)胞后油紅O染色，可見(jiàn)大量的暗紅色脂滴形成；成軟骨誘導(dǎo)21天后，培養(yǎng)皿中固定細(xì)胞后甲苯胺藍(lán)染色，可見(jiàn)胞漿中的淡藍(lán)色異染顆粒及細(xì)胞外基質(zhì)被染成淺藍(lán)色;經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，細(xì)胞CD90的陽(yáng)性表達(dá)率為99.6%；細(xì)胞CD73的陽(yáng)性表達(dá)率為99.9%；細(xì)胞CD105的陽(yáng)性表達(dá)率為96.5%;細(xì)胞CD34/45/116的綜合陽(yáng)性表達(dá)率為0.51%。 第二部分 根據(jù)CCK-8連續(xù)檢測(cè)7天的結(jié)果繪制的生長(zhǎng)曲線(xiàn)顯示，以6×103/cm2為鋪板密度的hBMSCs生長(zhǎng)曲線(xiàn)最佳。 第三部分 在加入每種不同濃度的ODN后，與對(duì)照組相比，終濃度為0.5mg/L的ODN FC003在第1天檢測(cè)到吸光值顯著升高（P0.01）；終濃度為1.0mg/L和4.0mg/L的ODN Sa05f 在第1天檢測(cè)到吸光值均顯著降低（分別為P0.01，P0.05）；終濃度為2.0mg/L的ODN MT01在連續(xù)3天內(nèi)的吸光值均明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（第1天P0.01，第2,3天P0.05）。 以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)： 本實(shí)驗(yàn)利用密度梯度離心法分離純化的hBMSCs，在標(biāo)準(zhǔn)的培養(yǎng)條件下MSCs能貼塑料瓶壁生長(zhǎng)；在體外能向成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞及軟骨細(xì)胞分化；符合Dominici M于2006年在Cytotherapy雜志上發(fā)表了關(guān)于人的MSCs鑒定的最低標(biāo)準(zhǔn)，為實(shí)驗(yàn)的后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)；以6.0×103/cm2的接種密度鋪板可獲得良好的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)；終濃度為2.0mg/L的ODN MT01可顯著促進(jìn)hBMSCs的增殖。 總之，作為抑制型寡核苷酸的ODN MT01可以促進(jìn)hBMSCs的增殖；本研究為組織工程種子細(xì)胞的體外擴(kuò)增提供了新的思路和一定的理論參考；然而，對(duì)于ODN MT01促進(jìn)增殖的機(jī)制和實(shí)際應(yīng)用，我們還需要大量的工作來(lái)完成。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：佳木斯大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R782

【參考文獻(xiàn)】

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1 賈延R

本文編號(hào)：2328054