【摘要】：顳下頜關(guān)節(jié)紊亂病(TMD)可導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨及關(guān)節(jié)盤的退行性改變,而在此過程中顳下頜關(guān)節(jié)(TMJ)滑膜襯里層中的成纖維樣滑膜細(xì)胞(FLSs)功能異常或凋亡,導(dǎo)致滑膜失去正常分泌功能。FLSs在滑膜細(xì)胞中占絕大多數(shù),存在于滑膜襯里中并呈三至四層的排列結(jié)構(gòu)。正常時(shí)FLSs胞膜上的透明質(zhì)酸合成酶2(HAS2)合成透明質(zhì)酸(HA), FLSs負(fù)責(zé)滑膜組織的正常分泌功能,營養(yǎng)關(guān)節(jié)軟骨；而在TMD時(shí)FLSs的分泌功能異常(例如分泌炎癥因子及基質(zhì)金屬降解酶類)或凋亡,導(dǎo)致滑膜正常分泌功能的喪失,繼而關(guān)節(jié)軟骨失去營養(yǎng),并遭受降解破壞。因而,構(gòu)建一個(gè)具有正常HA分泌功能的組織工程滑膜,替換病理性的滑膜組織,可能成為治療TMD的新方法。 根據(jù)溫敏細(xì)胞層技術(shù)構(gòu)建具有多層細(xì)胞結(jié)構(gòu)這一理論設(shè)計(jì)的滑膜細(xì)胞層不能準(zhǔn)確地模擬滑膜襯里層的細(xì)胞層外基質(zhì)成分,因?yàn)榧?xì)胞層技術(shù)依賴高密度細(xì)胞分泌的細(xì)胞外基質(zhì)將細(xì)胞粘結(jié)在一起,而Ⅰ型膠原占據(jù)滑膜膠原總量的一半,FLSs主要分泌HA,而非Ⅰ型膠原。因此,本研究擬通過一種新的方法構(gòu)建能夠模擬滑膜襯里層的多層結(jié)構(gòu)細(xì)胞層。本研究包括以下四個(gè)部分： 第一部分細(xì)胞培養(yǎng)及其鑒定 實(shí)驗(yàn)一人類顳下頜關(guān)節(jié)成纖維樣滑膜細(xì)胞及真皮成纖維細(xì)胞的體外培養(yǎng) 目的：獲得人類顳下頜關(guān)節(jié)正常的FLSs及作為對(duì)照的人類真皮成纖維細(xì)胞,以供構(gòu)建細(xì)胞層使用。 方法：正常滑膜組織取自三位髁突骨折手術(shù)患者,真皮組織塊取自唇腭裂修復(fù)術(shù)的患者,使用組織塊法進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。 結(jié)果：FLSs大約在3-5d時(shí)可從組織塊中爬出,呈梭形,2w后,細(xì)胞即可達(dá)到80%匯合,傳代后大約4d即可繼續(xù)傳代。真皮成纖維細(xì)胞活性較好,傳代后一般2-3d即可再次傳代。 結(jié)論：組織塊法培養(yǎng)兩種細(xì)胞,方法簡單,重復(fù)性高,細(xì)胞活性好,可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。 實(shí)驗(yàn)二成纖維樣滑膜細(xì)胞與真皮成纖維細(xì)胞的免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定 目的：鑒定FLSs及真皮成纖維細(xì)胞(DFs)。 方法：通過細(xì)胞免疫化學(xué)的方法鑒定上述兩種細(xì)胞。 結(jié)果：FLSs陽性表達(dá)vimentin, CD44, Hsp27,陰性表達(dá)CD14；真皮成纖維細(xì)胞陽性表達(dá)vimentin,陰性表達(dá)cytokeratin15. 結(jié)論：通過組織塊法培養(yǎng)的FLSs為B型滑膜細(xì)胞,真皮成纖維細(xì)胞為真皮來源而非上皮來源。 第二部分細(xì)胞層的構(gòu)建及其與天然滑膜的形態(tài)學(xué)對(duì)比觀察 實(shí)驗(yàn)三甲基纖維素溶液的制備與凝膠溫度的測定 目的：測試逆向溫敏材料甲基纖維素(MC)的溫敏特性。 方法：制備含有不同濃度PBS及不同濃度MC的MC混合溶液,按照傾斜試管法測定其凝膠溫度(GT)。 結(jié)果：隨著MC濃度的增高,MC混合溶液的GT降低；增加PBS的濃度也能夠降低GT。實(shí)驗(yàn)組"5%MC,8%PBS"的GT為20.5℃。 結(jié)論：實(shí)驗(yàn)組"5%MC,8%PBS"的GT較適合,可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。 實(shí)驗(yàn)四三層結(jié)構(gòu)細(xì)胞層的構(gòu)建 目的：使用新的方法構(gòu)建三層結(jié)構(gòu)的細(xì)胞。 方法：第一種方法通過一種原創(chuàng)的方式結(jié)合Ⅰ型膠原與FLSs;第二種方法先在孔板中心滴加MC,再在其上結(jié)合第一種方法制造三層結(jié)構(gòu)的細(xì)胞層。 結(jié)果：第一種無MC的細(xì)胞層制備方法穩(wěn)定,成功率高,而第二種有MC的細(xì)胞層制備方法不如第一種穩(wěn)定,偶爾Ⅰ型膠原會(huì)與孔壁提前分離。 結(jié)論：第一種制造三層結(jié)構(gòu)細(xì)胞層的方法,制作原料及獲取簡單,重復(fù)性高,可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。 實(shí)驗(yàn)五細(xì)胞層與人類正常滑膜的形態(tài)學(xué)觀察 目的：尋找三層結(jié)構(gòu)滑膜細(xì)胞層與人類正�；さ男螒B(tài)學(xué)相似性。 方法：使用無MC的方法制造具有三層細(xì)胞結(jié)構(gòu)滑膜細(xì)胞層,收集正�；そM織。進(jìn)行蘇木素伊紅(HE)染色及透射電鏡觀察。 結(jié)果：細(xì)胞層與正常滑膜的襯里層均含有3～4層平行排列的高密度梭形細(xì)胞,相互接觸的細(xì)胞之間未見橋粒、半橋粒或縫隙連結(jié)之類的細(xì)胞連結(jié)結(jié)構(gòu)。 結(jié)論：三層結(jié)構(gòu)的細(xì)胞層與天然滑膜襯里層在形態(tài)學(xué)上的相似。 實(shí)驗(yàn)六正�；づc顳下頜關(guān)節(jié)退行性變滑膜的形態(tài)學(xué)觀察 目的：對(duì)比分析人類正常滑膜與TMJ退行性變時(shí)滑膜的形態(tài)結(jié)構(gòu)特征。 方法：正常滑膜來自3位髁突骨折患者,病理性滑膜來自10位骨關(guān)節(jié)病患者,常規(guī)組織學(xué)處理,HE染色。 結(jié)果：正常滑膜襯里層由3～4的長梭形滑膜細(xì)胞組成。而退行性變時(shí)的滑膜呈現(xiàn)出幾種不同的表現(xiàn),襯里層可增厚至約10層細(xì)胞也可保持3～4層,抑或襯里層中的細(xì)胞凋亡大幅減少,滑膜下層大多情況可見血管增多,少數(shù)病例可正常。 結(jié)論：TMJ OA退行性變時(shí)滑膜襯里層在形態(tài)上異常,有待組織工程滑膜的替換修復(fù)。 第三部分細(xì)胞層的功能檢測 實(shí)驗(yàn)七細(xì)胞層的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA) 目的：檢測各種不同細(xì)胞層的HA分泌量 方法：分組為普通培養(yǎng)的FLSs(對(duì)照)、單層的FLSs細(xì)胞層、三層的FLSs細(xì)胞層以及三層的DFs細(xì)胞層,使用ELISA法測定培養(yǎng)基中HA的分泌量。 結(jié)果：三層FLSs細(xì)胞層的HA分泌量高于其他組,在第1d和第3d時(shí),該組的HA分泌量分別是單層FLSs細(xì)胞層HA分泌量的2.53倍和3.27倍。 結(jié)論：FLSs具有分泌透明質(zhì)酸的功能,FLSs培養(yǎng)在Ⅰ型膠原上能分泌更多的HA。三層結(jié)構(gòu)的FLSs細(xì)胞層能分泌大約3倍的HA。 實(shí)驗(yàn)八細(xì)胞增殖活性實(shí)驗(yàn) 目的：比較不同培養(yǎng)方式的FLSs的細(xì)胞增殖活性。 方法：分組為普通培養(yǎng)FLSs.單層FLSs細(xì)胞層和三層FLSs細(xì)胞層,使用CCK-8法測定各組的細(xì)胞增殖活性。 結(jié)果：單層FLSs細(xì)胞層的OD值在第3d時(shí)高于普通培養(yǎng)組的OD值。三層FLSs細(xì)胞層的OD值在第1d和第3d時(shí)均顯著高于其他兩組。 結(jié)論：FLSs在Ⅰ型膠原上的增殖活性高于其在普通平板培養(yǎng)上的活性,FLSs在三層結(jié)構(gòu)細(xì)胞層的培養(yǎng)環(huán)境中具備增殖活性。 實(shí)驗(yàn)九Realtime-PCR檢測HAS2基因在不同細(xì)胞層中的表達(dá) 目的：對(duì)比不同細(xì)胞層的HAS2基因表達(dá)情況。 方法：分組普通培養(yǎng)FLSs組、單層FLSs細(xì)胞層組、三層FLSs細(xì)胞層組及三層DFs細(xì)胞層組,通過Realtime-PCR法檢測各組HAS2基因的表達(dá)。 結(jié)果：HAS2的表達(dá)在單層FLSs細(xì)胞層中顯著高于普通培養(yǎng)組,HAS2表達(dá)在三層FLSs細(xì)胞層中表達(dá)量最高。 結(jié)論：Ⅰ型膠原能促進(jìn)FLSs表達(dá)更高水平的HAS2基因,同時(shí)三層結(jié)構(gòu)細(xì)胞層的三維培養(yǎng)方式能使FLSs中HAS2基因表達(dá)最高。 實(shí)驗(yàn)十RT-PCR檢測天然滑膜與人工滑膜HAS2基因的表達(dá)差異 目的：對(duì)比人類正常滑膜與三層FLSs細(xì)胞層(人工滑膜)在HAS2基因的表達(dá)。 方法：收集髁突骨折手術(shù)患者的滑膜組織,及三層FLSs細(xì)胞層,使用RT-PCR法檢測HAS2基因表達(dá)情況。 結(jié)果：HAS2基因在人工滑膜中的表達(dá)略高于其在人類滑膜中的表達(dá),但二者沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 結(jié)論：人工滑膜與人類滑膜在HAS2表達(dá)上無差異。 第四部分裸鼠皮下移植實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)十一細(xì)胞層的裸鼠皮下移植研究 目的：探索三層FLSs細(xì)胞層再裸鼠皮下環(huán)境中的存活及功能表達(dá)情況。 方法：將Ⅰ型膠原、脫細(xì)胞真皮及三層結(jié)構(gòu)的FLSs細(xì)胞層植入裸鼠皮下,1w及2w周處死,組織學(xué)與免疫組化處理觀察。 結(jié)果：1w時(shí),Ⅰ型膠原與脫細(xì)胞真皮中的膠原遭受降解,三層FLSs與起支持作用的Ⅰ型膠原分離。2w時(shí),對(duì)照組的植入物均降解消失,而在細(xì)胞層植入組,多層平行排列的細(xì)胞位于支持膠原表面,而支持膠原中有宿主成纖維細(xì)胞和血管的侵入。CD44與HAS2表達(dá)于支持膠原表面層狀排列的細(xì)胞中。HA表達(dá)于CD44陽性細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)中。 結(jié)論：三層結(jié)構(gòu)的FLSs細(xì)胞層在裸鼠皮下環(huán)境中,較對(duì)照組具有更強(qiáng)的抵抗膠原降解的能力。在體內(nèi)環(huán)境中FLS保持分化特性,具有合成與分泌HA的功能。 小結(jié) 本研究首次對(duì)顳下頜關(guān)節(jié)滑膜進(jìn)行組織工程構(gòu)建,并使用了一種獨(dú)創(chuàng)的方法構(gòu)建滑膜細(xì)胞層,使得三層結(jié)構(gòu)的滑膜細(xì)胞層在形態(tài)上與天然顳下頜關(guān)節(jié)滑膜襯里層相似。功能檢測證實(shí),三層結(jié)構(gòu)的滑膜細(xì)胞層具有合成與分泌透明質(zhì)酸的能力。裸鼠皮下移植實(shí)驗(yàn)證實(shí)三層結(jié)構(gòu)的滑膜細(xì)胞層具有抗降解的能力,并保持分泌透明質(zhì)酸的功能。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R782.6

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2311093