本文選題：白介素17 + 人牙周膜成纖維細胞��； 參考：《廣西醫(yī)科大學》2017年碩士論文

【摘要】：實驗目的:通過觀察p38MAPK信號通路抑制劑(SB203580)對人牙周膜成纖維細胞(HPDLF)表達RANKL、OPG的影響,探究p38MAPK信號通路是否參與IL-17、HPDLF介導破骨細胞分化的過程。明確IL-17誘導人牙周膜細胞促骨吸收作用的可能信號轉(zhuǎn)導途徑,探討IL-17參與正畸相關炎性牙根吸收的發(fā)生機制。實驗方法:1.采用組織塊培養(yǎng)法,體外培養(yǎng)原代HPDLF,并進行傳代純化。取第4代細胞,采用免疫熒光細胞化學法,對所培養(yǎng)的細胞進行來源鑒定。MTT法分別檢測0、2.5、5、10、20、40μmol/L的p38MAPK抑制劑對HPDLF增殖活性的影響。2.Western blot檢測20ng/ml的IL-17刺激HPDLF(0、20、40、60、80min)后,細胞內(nèi)p38MAPK磷酸化蛋白的表達情況。3.實驗分為六組:A組(空白對照)、B組(DMSO)、C組(抑制劑)、D組(IL-17)、E組(IL-17+DMSO)、F組(IL-17+抑制劑)。按照分組,用10μmol/L的SB203580,20ng/ml的IL-17處理細胞。RT-PCR檢測HPDLF中RANKL、OPG因子的mRNA表達水平;Western blot、ELISA檢測HPDLF中RANKL、OPG因子的蛋白表達水平。實驗結(jié)果:1.培養(yǎng)的細胞為長梭形,呈放射狀生長;傳代后細胞均勻分布,生長狀態(tài)穩(wěn)定。經(jīng)鑒定該細胞為來源于間充質(zhì)細胞,且非上皮來源的細胞。結(jié)合取材部位可判定細胞為HPDLF。MTT結(jié)果顯示,以濃度為0-40μmol/L的SB203580分別刺激HPDLF,0-10μmol/L中,OD值隨著濃度的增加持續(xù)升高,HPDLF增殖活性逐漸增強。在10μmol/L中,OD值最大,HPDLF增殖活性達到最強。10-40μmol/L中,OD值隨著濃度的增加逐漸下降,HPDLF增殖活性逐漸降低。2.在20ng/ml的IL-17刺激下,磷酸化p38MAPK(p-p38MAPK)的相對表達量隨著時間的增加而增大。在60min時達最高水平,80min時開始下降。3.與空白對照組比較,IL-17刺激后RANKL的mRNA、蛋白表達量升高;OPG的mRNA表達量降低;RANKL/OPG的mRNA比值升高。加入抑制劑后,IL-17刺激RANKL的mRNA、蛋白表達量降低;OPG的m RNA表達量升高,RANKL/OPG的mRNA比值降低。IL-17調(diào)控RANKL、OPGmRNA表達的作用,被p38MAPK抑制劑阻斷。實驗結(jié)論:1.組織塊培養(yǎng)法成功地建立了人牙周膜成纖維細胞系。經(jīng)傳代,細胞純化,細胞生物學性狀穩(wěn)定。適宜濃度的SB203580對HPDLF增殖活性有促進作用,但過大濃度的SB203580抑制HPDLF增殖,其中10μmol/L為HPDLF的最適濃度。2.IL-17能激活p38MAPK蛋白,且存在時間依賴性。IL-17通過p38MAPK通路促進HPDLF中RANKL的表達,抑制OPGmRNA表達;上調(diào)RANKL/OPG的mRNA比值。
[Abstract]:Aim: to investigate the effect of p38MAPK signaling pathway inhibitor (SB203580) on the expression of RANKLL-OPG in human periodontal ligament fibroblasts (HPDLFs), and to explore whether the p38MAPK signaling pathway is involved in the process of osteoclast differentiation mediated by IL-17 HPDLF. To clarify the possible signal transduction pathway of IL-17 inducing bone resorption in human periodontal ligament cells and to explore the mechanism of IL-17 involved in orthodontic inflammatory root resorption. Experimental method: 1. Primary HPD LF was cultured in vitro and purified by tissue mass culture. In the fourth passage, the cultured cells were identified by immunofluorescence cytochemistry, and the proliferation activity of HPDLF was detected by p38MAPK inhibitor of 02.5U / 10 ~ 2040 渭 mol/L. 2. Western blot was used to detect the effect of IL-17 of 20ng/ml on the proliferation of HPDLF for 6080 min. Expression of p38MAPK phosphorylated protein in cells. The experiment was divided into six groups: group A (control group B) and group C (group C). The mRNA expression level of RANKL- OPG factor in HPDLF was detected by RT-PCR with 10 渭 mol/L SB203580 / 20ng / ml IL-17 treatment cells. The protein expression of RANKL- OPG factor in HPDLF was detected by Western-blottmeter Elisa. The result of the experiment was 1: 1. The cultured cells were long fusiform and radially grown, and the cells were evenly distributed after passage, and the growth state was stable. The cells were identified to be derived from mesenchymal cells and non-epithelial cells. In combination with the site of HPDLF.MTT, the results of HPDLF.MTT showed that the OD value of SB203580 stimulated with 0-40 渭 mol/L in 0-10 渭 mol/L increased continuously with the increase of concentration, and the proliferative activity of HPDLF increased gradually. In 10 渭 mol/L, the maximum OD value of HPDLF was the highest. 10-40 渭 mol/L. The OD value of HPDLF decreased gradually with the increase of concentration, and the proliferative activity of HPDLF decreased gradually. 2. Under the stimulation of 20ng/ml IL-17, the relative expression of phosphorylated p38 MAPK- p-p38 MAPK increased with the increase of time. It began to decrease at 80 minutes after reaching the highest level in 60min. Compared with control group, mRNAs of RANKL stimulated by IL-17 increased the mRNA expression of OPG and decreased the mRNA ratio of RANKL / OPG. After adding the inhibitor, the mRNA expression of RANKL was stimulated by IL-17. The protein expression decreased, the expression of m RNA increased and the mRNA ratio of RANKL / OPG decreased. IL-17 regulated the expression of RANKL / OPG mRNA, which was blocked by p38MAPK inhibitor. Conclusion: 1. A human periodontal ligament fibroblast cell line was successfully established by tissue mass culture. After subculture, the cells were purified and the biological properties of the cells were stable. The appropriate concentration of SB203580 promoted the proliferation of HPDLF, but too much concentration of SB203580 inhibited the proliferation of HPDLF. The optimal concentration of HPDLF was 10 渭 mol/L. 2. IL-17 could activate p38MAPK protein, and the expression of RANKL in HPDLF could be enhanced by p38MAPK pathway. Inhibition of OPGmRNA expression and up-regulation of mRNA ratio of RANKL/OPG.
【學位授予單位】：廣西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R783.5

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本文編號：1938455