本文選題：外胚間充質(zhì)干細(xì)胞　切入點(diǎn)：牙向分化　出處：《第三軍醫(yī)大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：長(zhǎng)期以來(lái),因齲病、牙周病、創(chuàng)傷等原因造成的牙齒缺失對(duì)人類造成較大的困擾,包括種植牙在內(nèi)的各種缺失牙修復(fù)方法各有其局限,尚不能完全恢復(fù)缺牙患者的生理和心理功能。牙組織工程和牙再生醫(yī)學(xué)的出現(xiàn)提供了一條更為適宜的思路,即重新啟動(dòng)牙齒發(fā)育進(jìn)程,以修復(fù)牙體、牙周組織缺損,直至全牙再生。在牙組織工程中,適宜種子細(xì)胞的選擇是組織工程三要素中最為重要的內(nèi)容。神經(jīng)嵴來(lái)源的外胚間充質(zhì)干細(xì)胞(ectomesenchymal stem cells,EMSCs)和外胚層來(lái)源的上皮細(xì)胞的連續(xù)相互作用貫穿于牙形態(tài)發(fā)生的始終。在經(jīng)典的牙發(fā)育理論中,牙齒的發(fā)生是由這兩個(gè)胚層細(xì)胞經(jīng)復(fù)雜的上皮-間充質(zhì)相互作用,并伴隨著按嚴(yán)格時(shí)-空順序表達(dá)的信號(hào)分子“瀑布”調(diào)控完成的。在胚胎發(fā)育早期,神經(jīng)嵴細(xì)胞從中、后腦的神經(jīng)嵴經(jīng)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化、脫層后遷移至第一腮弓,并組成第一腮弓的大部分組織,此時(shí)稱為外胚間充質(zhì)干細(xì)胞。牙板形成后,牙齒發(fā)育開(kāi)始啟動(dòng),牙板上皮來(lái)源的信號(hào)分子傳遞至其下方神經(jīng)嵴來(lái)源的EMSCs,引起其增殖、凝聚,經(jīng)牙板期、蕾狀期、帽狀期和鐘狀期等明確的牙齒發(fā)育階段,在釉質(zhì)形成后,牙根發(fā)育啟動(dòng)并最終萌出至咬合平面,完成牙齒的發(fā)育。在這一過(guò)程中,神經(jīng)嵴來(lái)源的EMSCs形成了除牙冠釉質(zhì)外全部牙體組織結(jié)構(gòu),包括其派生的牙乳頭間充質(zhì)細(xì)胞,其最終分化為成牙本質(zhì)細(xì)胞并分泌基質(zhì),形成牙髓-牙本質(zhì)復(fù)合體、以及其派生的牙囊祖細(xì)胞(dental follicle progenitor cells,DFPCs)最終形成的牙骨質(zhì)、牙周膜和部分根周牙槽骨等。由此可見(jiàn),牙齒發(fā)育早期的EMSCs具有雙向分化特性,即向成牙本質(zhì)細(xì)胞和牙囊祖細(xì)胞及其子代細(xì)胞分化的特性,理論上EMSCs作為牙組織工程的種子細(xì)胞,具有形成除釉質(zhì)外牙齒全部結(jié)構(gòu)的能力。但這一胚胎發(fā)育過(guò)渡性的干細(xì)胞在體外誘導(dǎo)環(huán)境下,是否具有牙向分化能力,尚待進(jìn)一步明確。再者,目前牙發(fā)育相關(guān)研究表明,尚有非神經(jīng)嵴來(lái)源的間充質(zhì)參與牙形態(tài)發(fā)生,牙組織工程相關(guān)研究也提示,除了神經(jīng)嵴來(lái)源的牙齒間充質(zhì)干細(xì)胞,非神經(jīng)嵴來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞,如骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞等也可表達(dá)牙向分化能力。神經(jīng)嵴源性和非神經(jīng)嵴源性的間充質(zhì)干細(xì)胞作為牙組織工程的種子細(xì)胞,哪一個(gè)更為適宜,尚無(wú)明確定論。因此,目前有三個(gè)亟待解決的問(wèn)題:(1)神經(jīng)嵴來(lái)源的EMSCs在體外牙向誘導(dǎo)環(huán)境下是否具有牙向分化能力?(2)神經(jīng)嵴來(lái)源的emscs作為種子細(xì)胞,和非神經(jīng)嵴來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞比較,其成牙潛能如何?(3)牙胚的發(fā)生是通過(guò)口腔上皮與顱頜神經(jīng)嵴來(lái)源emscs細(xì)胞間的信號(hào)分子網(wǎng)絡(luò)調(diào)控、進(jìn)而推動(dòng)的復(fù)雜發(fā)育過(guò)程,而胚胎發(fā)育早期emscs參與牙齒發(fā)育的內(nèi)在分子調(diào)控機(jī)制尚待進(jìn)一步明確。因此,研究牙發(fā)育早期emscs的成牙潛能和內(nèi)在分子機(jī)制,可以為完善牙發(fā)育學(xué)理論,以及為牙組織工程的種子細(xì)胞選擇和構(gòu)建組織工程牙胚,提供初步的依據(jù)和策略。主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果目的:本課題主要對(duì)比研究大鼠胚胎11.5d(e11.5d)第一腮弓神經(jīng)嵴來(lái)源的emscs和非神經(jīng)嵴來(lái)源的emscs,在體外、體內(nèi)成牙誘導(dǎo)微環(huán)境下的成牙潛能差異;利用細(xì)胞凝聚技術(shù)還原牙齒器官發(fā)育模式,從上皮-間充質(zhì)相互作用和牙發(fā)育角度探討明確的神經(jīng)嵴來(lái)源的emscs在體外、體內(nèi)的牙向分化模式;進(jìn)一步以基因芯片技術(shù)探討神經(jīng)嵴來(lái)源的emscs在牙向分化過(guò)程中可能存在的分子機(jī)制,為牙發(fā)育機(jī)制和牙組織工程再生提供可能的理論依據(jù)和策略。方法:1.為明確p75-ntr標(biāo)記的emscs在牙發(fā)育中的時(shí)空變化,我們通過(guò)對(duì)e11.5-e18.5d大鼠胚胎牙齒不同發(fā)育階段的連續(xù)觀察,利用he和ihc技術(shù)對(duì)比觀察神經(jīng)嵴細(xì)胞的標(biāo)記物,p75神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體(p75-neurotrophinreceptor,p75-ntr)以及胚胎干細(xì)胞標(biāo)記物oct4和sox2,在牙發(fā)育各個(gè)時(shí)期emscs中的時(shí)空表達(dá)和生物學(xué)功能;2.為獲取明確的神經(jīng)嵴來(lái)源的emscs,我們以流式細(xì)胞技術(shù)分選e11.5d大鼠胚胎第一腮弓來(lái)源的p75-ntr陽(yáng)性emscs(p_(75)~+emscs),原代細(xì)胞培養(yǎng)后進(jìn)行增殖能力檢測(cè)和干細(xì)胞鑒定;3.為明確p_(75)~+emscs是否具有牙向分化能力,及探討與非神經(jīng)嵴來(lái)源的p75-ntr陰性emscs(p75-emscs)的牙向分化能力差異,我們利用大鼠切牙頸環(huán)上皮干細(xì)胞系hat-7條件培養(yǎng)液和切牙頸環(huán)上皮干細(xì)胞,通過(guò)體外、體內(nèi)誘導(dǎo)模式對(duì)p75進(jìn)行牙向分化誘導(dǎo)。體外誘導(dǎo)模式下以hat-7條件培養(yǎng)液誘導(dǎo)0、4、8、12d后觀察細(xì)胞形態(tài)變化,透射電鏡(tem)檢測(cè)誘導(dǎo)前后的細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期變化;對(duì)比p75和蛋白dsp、dmp1等變化;體內(nèi)誘導(dǎo)模式下,以原代大鼠切牙頸環(huán)上皮干細(xì)胞重組p_(75)~+emscs/p75-emscs(細(xì)胞比例2:3),以i型膠原蛋白為重組體支架,待細(xì)胞自發(fā)凝聚后,大鼠腎被膜下移植,4周后取材進(jìn)行ihc鑒定成牙關(guān)鍵蛋白dsp和dmp1表達(dá);4.為進(jìn)一步探討神經(jīng)嵴和非神經(jīng)嵴來(lái)源的emscs牙向分化差異的分子機(jī)制,我們以基因芯片微陣列分析e11.5dp_(75)~+emscs和p75-emscs基因表達(dá)譜差異基因,kegg代謝通路分析牙發(fā)育相關(guān)信號(hào)通路。然后以sirna-smad4沉默p_(75)~+emscs的tgf-β信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白smad4,smad4激活劑kartogenin激活p75-emscs的smad4表達(dá),以上兩組細(xì)胞在hat-7條件培養(yǎng)液牙向分化誘導(dǎo)后,以westernblot檢測(cè)tgf-β信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白smad4對(duì)p_(75)~+emscs和p75-emscs牙向分化能力的影響。結(jié)果:1.p75-ntr作為公認(rèn)的神經(jīng)嵴細(xì)胞的標(biāo)記物,在牙齒各個(gè)發(fā)育時(shí)期的牙源性間充質(zhì)中都連續(xù)表達(dá),可以作為神經(jīng)嵴來(lái)源的emscs的連續(xù)標(biāo)記物。其同時(shí)在牙上皮表達(dá),顯示其參與了上皮和間充質(zhì)的相互作用;胚胎干細(xì)胞的標(biāo)記物oct4和sox2的表達(dá)在牙發(fā)育早期表達(dá)較弱,在牙發(fā)育后期(鐘狀期)的上皮-間充質(zhì)界面強(qiáng)烈表達(dá),顯示其協(xié)同p75-ntr調(diào)控上皮-間充質(zhì)相互作用;2.分選前emscs形態(tài)具有高度異質(zhì)性,顯示不同族群的細(xì)胞雜居生長(zhǎng)。分選后的p_(75)~+emscs呈短梭三角形,形態(tài)趨于一致。p_(75)~+emscs分選比率為24.5%提示其在第一腮弓組織中有較高的比率。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)顯示p_(75)~+emscs的增殖能力顯著高于p75-emscs。免疫熒光鑒定p_(75)~+emscs具備間充質(zhì)干細(xì)胞表面抗原(stro-1、vimintin)和神經(jīng)嵴細(xì)胞(p75-ntr,ap2α,hnk-1)雙重標(biāo)記物,同時(shí)胚胎源性標(biāo)記物oct4陽(yáng)性,提示為具有神經(jīng)嵴源性和間充質(zhì)干細(xì)胞雙重特性的外胚間充質(zhì)干細(xì)胞(emscs);3.p_(75)~+emscs在體外成牙誘導(dǎo)模式下細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖、細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化以及高表達(dá)成牙本質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物dspp(dsp)和dmp1,證實(shí)細(xì)胞分化為具有分泌功能的成牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞。p_(75)~+emscs的成牙本質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物dspp和dmp1的mrna顯著高于p75-emscs。體內(nèi)在牙源性上皮干細(xì)胞的誘導(dǎo)下,p_(75)~+emscs呈一定層次圍繞島型牙源性上皮,強(qiáng)烈表達(dá)dsp和dmp1,而p75體外、體內(nèi)兩種成牙誘導(dǎo)模式下證實(shí),p75p75-emscs;4.對(duì)比p75≥1.5),kegg代謝通路分析顯示涉及多個(gè)信號(hào)通路,其中tgf-β信號(hào)通路與牙齒發(fā)育密切相關(guān)。在差異基因中,smad4是tgf-β信號(hào)通路中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)。westernblot和Real-time PCR的結(jié)果也證實(shí)P_(75)~+EMSCs的Smad4表達(dá)水平顯著高于P75-EMSCs。P_(75)~+EMSCs經(jīng)特異性的si RNA-Smad4沉默后,其成牙能力相應(yīng)受到抑制,而P75-EMSCs經(jīng)smad4激活劑激活后,其成牙能力顯著增加。這一結(jié)果表明,P_(75)~+EMSCs較P75-EMSCs具有更為活躍的成牙分化潛能的機(jī)制,可能在于其通過(guò)smad4介導(dǎo)的TGF-β信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)。結(jié)論:綜上所述,E11.5d大鼠胚胎腮弓來(lái)源的P_(75)~+EMSCs作為明確的神經(jīng)嵴來(lái)源的外胚間充質(zhì)干細(xì)胞,對(duì)比非神經(jīng)嵴來(lái)源的P75-EMSCs,在體外和體內(nèi)兩種成牙誘導(dǎo)模式下都顯示更為活躍的牙向分化潛能。這一能力可能是通過(guò)Smad4為核心的TGF-β/Smad4信號(hào)通路介導(dǎo)獲得的。P_(75)~+EMSCs有希望作為一種新的干細(xì)胞資源,為研究完善牙發(fā)育理論,以及牙組織工程和牙再生醫(yī)學(xué)提供幫助。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R781

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 蒙一純,ＰｈｉｌｉｐＢｒａｕｅｒ;早期雞胚神經(jīng)管和微核神經(jīng)嵴的細(xì)胞凋亡[J];解剖科學(xué)進(jìn)展;1997年03期

2 張建中;S—100蛋白在神經(jīng)嵴起源組織及其腫瘤中的分布[J];實(shí)用癌癥雜志;1988年02期

3 蔡良琬;神經(jīng)組織發(fā)育與再生的研究進(jìn)展[J];基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床;1994年06期

4 于蕾;倪潔麗;馬俊青;陳文靜;;Rap1b在斑馬魚(yú)神經(jīng)嵴中表達(dá)情況的初探[J];口腔生物醫(yī)學(xué);2013年03期

5 Bahn CF ,王傳富;以神經(jīng)嵴起源為根據(jù)的角膜內(nèi)皮疾病分類[J];眼科新進(jìn)展;1986年02期

6 陸穎靜;陳樹(shù)寶;陸歐倫;;心臟神經(jīng)嵴受損與心臟畸形發(fā)生的關(guān)系[J];中華兒科雜志;1997年01期

7 劉積才;譚義書(shū);;神經(jīng)嵴起源的少見(jiàn)腫瘤[J];腫瘤防治研究;1988年04期

8 張華;馮永;;PAX3基因?qū)ι窠?jīng)嵴發(fā)育的調(diào)控及其在Waardenburg綜合征發(fā)病中的作用研究[J];聽(tīng)力學(xué)及言語(yǔ)疾病雜志;2014年02期

9 趙曉晴;心臟神經(jīng)嵴發(fā)育與心臟錐干部畸形[J];國(guó)外醫(yī)學(xué)(兒科學(xué)分冊(cè));2004年01期

10 劉向陽(yáng);王曄;宋維亞;張臻;;Wnt1-Cre標(biāo)記心臟神經(jīng)嵴來(lái)源細(xì)胞在房室瓣分布的實(shí)驗(yàn)研究[J];中華臨床醫(yī)師雜志(電子版);2012年22期

相關(guān)會(huì)議論文 前1條

1 藺海燕;劉芳;張傳森;張志英;孔征東;張喜;;移植了毛囊神經(jīng)嵴干細(xì)胞源性神經(jīng)元和施萬(wàn)細(xì)胞的神經(jīng)移植體的體外特性[A];中國(guó)解剖學(xué)會(huì)2011年年會(huì)論文文摘匯編[C];2011年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前3條

1 王曉鈺;高糖環(huán)境誘導(dǎo)的過(guò)度自噬抑制雞胚顱面部神經(jīng)嵴產(chǎn)生[D];暨南大學(xué);2015年

2 李彥希;曲馬多引起胚胎發(fā)育缺陷的分子機(jī)制[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2016年

3 行勇軍;神經(jīng)嵴來(lái)源外胚間充質(zhì)干細(xì)胞在牙向分化中的潛能及相關(guān)機(jī)制的研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2016年

，

本文編號(hào)：1696592