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自噬在牙發(fā)育及牙髓再生中的作用

發(fā)布時間:2018-04-01 06:28

  本文選題:自噬 切入點:凋亡 出處:《武漢大學(xué)》2014年博士論文


【摘要】:第一部分小鼠牙胚發(fā)育中自噬的時空性表達(dá)模式分析 目的:自噬是一種由溶酶體和胞內(nèi)體介導(dǎo)的細(xì)胞自我降解過程,在細(xì)胞增殖、分化和死亡過程中發(fā)揮重要作用。近來研究表明,自噬與凋亡緊密關(guān)聯(lián)參與胚胎的發(fā)育過程。本研究旨在探索小鼠牙胚發(fā)育中自噬的時空性表達(dá)模式,并初步分析其與凋亡的相關(guān)性。 方法:收集不同發(fā)育時期的小鼠下頜第一磨牙牙胚,實時定量RT-PCR和Westernblot分析自噬相關(guān)分子的mRNA和蛋白表達(dá)水平;免疫組織化學(xué)定位自噬相關(guān)蛋白LC3和Beclin1;自噬及凋亡相關(guān)分子免疫熒光雙標(biāo)及三標(biāo)技術(shù)共定位(LC3/TUNEL; LC3/Beclinl/Cl-Caspase-3)分析自噬和凋亡的位置關(guān)系;進(jìn)一步通過透射電鏡觀察自噬小體與凋亡的超微結(jié)構(gòu)及其定位分布。 結(jié)果:實時定量RT-PCR和Western blot結(jié)果顯示,在小鼠牙胚發(fā)育的不同時期均有自噬相關(guān)基因(Atg5, Atg7, Atg12)和蛋白(Atg5-Atg12復(fù)合物,Beclin1的全片段及剪切片段及LC3Ⅱ)的表達(dá)。免疫組織化學(xué)分析表明,在牙胚發(fā)育的不同時期,LC3定位于牙胚的不同部位。在胚胎期,LC3在成釉器和牙乳頭均有表達(dá),尤其是E14.5時期的頸環(huán)和原發(fā)性釉節(jié)(PEK)面向間充質(zhì)的部分;而出生后期,LC3則主要表達(dá)于成釉器、成牙本質(zhì)細(xì)胞、牙囊細(xì)胞及Hertwig's上皮根鞘。與此同時,Beclin1的表達(dá)模式與LC3不完全一致,主要體現(xiàn)在Beclin1有部分胞核表達(dá),并且其在胚胎期主要分布于成釉器。免疫熒光雙標(biāo)捕獲LC3和TUNEL信號存在部分共定位,主要在E14.5的PEK、E16.5的中間層和外釉上皮、P5.5的中間層和星網(wǎng)狀層。免疫熒光三標(biāo)發(fā)現(xiàn)在E14.5原發(fā)性釉節(jié)中,Beclin1、LC3和C1-Caspase-3相互存在部分共定位,且其中存在Beclin1+LC3+Caspase-3+三陽性的細(xì)胞。透射電鏡觀察進(jìn)一步證實,在E14.5的原發(fā)性釉節(jié)和P5.5的星網(wǎng)狀層,均可見部分自噬小體和凋亡細(xì)胞核有共定位。 結(jié)論:自噬存在于小鼠牙胚發(fā)育的過程中,且與凋亡存在部分共定位,推測其可能通過Beclin1與凋亡相互作用,共同調(diào)控牙形成。本研究為進(jìn)一步闡明牙發(fā)育的機制提供了基本資料。 第二部分自噬參與SDF-1a介導(dǎo)的牙髓干細(xì)胞遷移及異位牙髓再生 目的:基于再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展,牙髓根尖周病治療衍生出“牙髓再生治療”理念:即構(gòu)建具有生物活性的牙髓組織,恢復(fù)牙體組織的生命和活力。SDF-1α隸屬于CXC趨化因子亞家族,在造血干細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞的募集、遷移以及分化中發(fā)揮關(guān)鍵作用。近來研究發(fā)現(xiàn),SDF-1α可促進(jìn)犬牙髓干細(xì)胞遷移,并且膠原負(fù)載SDF-1α整合犬牙髓干細(xì)胞(Denal pulp stem cells, DPSCs)可有效實現(xiàn)牙髓再生。但有關(guān)SDF-1α介導(dǎo)牙髓再生的機制尚不明確。第一部分實驗結(jié)果顯示自噬存在于發(fā)育中的牙乳頭和成牙本質(zhì)細(xì)胞中,提示自噬可能參與牙髓再生。本實驗旨在探討自噬對SDF-1α介導(dǎo)DPSCs遷移的調(diào)控效應(yīng);進(jìn)一步應(yīng)用絲素蛋白支架負(fù)載SDF-1α并整合DPSCs建立異位牙髓再生模型,探討自噬在再生牙髓樣組織中的表達(dá)及作用。 方法:有限稀釋法原代培養(yǎng)人牙髓干細(xì)胞,克隆形成試驗、細(xì)胞免疫熒光、流式細(xì)胞術(shù)和多向分化檢測鑒定其干細(xì)胞特性。CCK8、劃痕和Transwell試驗,檢測SDF-1α對DPSCs細(xì)胞活力和遷移的影響;細(xì)胞免疫熒光檢測SDF-1α刺激下DPSCs細(xì)胞骨架和黏著斑蛋白的改變。細(xì)胞免疫熒光、Western blot及透射電鏡檢測SDF-1α對DPSCs自噬表達(dá)水平的影響,并應(yīng)用自噬抑制劑及激活劑探討自噬對SDF-1α介導(dǎo)DPSCs遷移的調(diào)控效應(yīng)。冷凍干燥法制取多孔絲素蛋白支架并負(fù)載SDF-1α,掃描電鏡和傅里葉紅外光譜檢測其表面形貌及物理化學(xué)特征。通過將支架整合經(jīng)過預(yù)處理的牙根段(牙根段-絲素蛋白支架復(fù)合體)以模擬牙髓微環(huán)境,接種DPSCs后,體外培養(yǎng)后掃描電鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)或裸鼠皮下移植,建立異位牙髓再生模型。HE、Masson三色法、苦昧酸-天狼星紅染色、、Vestern blot、免疫組織化學(xué)以及免疫熒光對再生組織進(jìn)行組織學(xué)形態(tài)及增殖、成血管、成神經(jīng)、成骨、成牙相關(guān)指標(biāo)檢測。Western blot、免疫組織化學(xué)、透射電鏡以及免疫熒光共定位進(jìn)一步檢測自噬相關(guān)分子及其與血管內(nèi)皮標(biāo)記分子的共定位特點。 結(jié)果:分離培養(yǎng)的DPSCs表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記、具有克隆形成能力以及多向分化潛能。SDF-1α(0-200ng/ml)對DPSCs的細(xì)胞活力基本無影響。值得注意的是,SDF-1α可劑量依賴性促進(jìn)DPSCs遷移,伴隨細(xì)胞骨架改建以及黏著斑組裝(Vincullin, p-Paxillin, p-FAK)。與此同時,SDF-1α可激活DPSCs自噬相關(guān)蛋白(Beclin I, LC3, Atg5-Atg12復(fù)合體)表達(dá)及自噬小體的形成。并且,在SDF-1α刺激DPSCs前用自噬抑制劑或激活劑預(yù)處理,發(fā)現(xiàn)自噬抑制劑(3-MA,氯喹)預(yù)處理,可不同程度阻斷SDF-1α激發(fā)的DPSCs遷移;而自噬激活劑(Rapamycin)預(yù)處理則使DPSCs遷移水平進(jìn)一步提升。絲素蛋白支架孔徑約為200±46μm,負(fù)載SDF-1α后并未改變支架的分子構(gòu)象。DPSCs在上述支架可表現(xiàn)良好的鋪展形態(tài)、增殖并伴隨細(xì)胞外基質(zhì)的分泌。牙根段-負(fù)載SDF-1α的絲素蛋白支架復(fù)合體整合人牙髓干細(xì)胞在裸鼠皮下可形成牙髓樣組織,表現(xiàn)為富含血管和類似正常牙髓的新生膠原纖維形成,且牙本質(zhì)壁沉積有DSP表達(dá)陽性的新生礦化組織。值得注意的是,再生組織中存在自噬及相關(guān)分子(Atg5,LC3)表達(dá)和自噬小體的形成。此外,LC3和血管內(nèi)皮標(biāo)記分子CD31呈現(xiàn)部分共定位的特征,且血管內(nèi)皮超微結(jié)構(gòu)中可見自噬小體的存在,提示自噬可能參與了異位再生牙髓組織的成血管過程。再生牙髓樣組織由供體細(xì)胞和宿主細(xì)胞共同組成,且在無細(xì)胞移植組,SDF-1α亦可有效募集宿主細(xì)胞形成含有血管和新生膠原纖維的結(jié)締組織,伴隨自Atg5和LC3的表達(dá)。 結(jié)論:絲素蛋白支架負(fù)載SDF-1α可有效實現(xiàn)異位牙髓再生;自噬可能通過正向調(diào)控SDF-1α介導(dǎo)的DPSCs遷移及參與自體干細(xì)胞募集參與牙髓再生的過程。 第三部分“干細(xì)胞歸巢”下SDF-1α介導(dǎo)的犬成熟恒牙原位牙髓再生及自噬表達(dá)相關(guān)研究 目的:“干細(xì)胞歸巢”模式,即通過有效募集機體內(nèi)源性干細(xì)胞作為種子細(xì)胞,從而實現(xiàn)組織/器官再生。最近有學(xué)者提出基于“干細(xì)胞歸巢”可初步實現(xiàn)犬成熟恒牙原位牙髓再生,然而其再生組織呈現(xiàn)廣泛彌散性鈣化,與正常牙髓相去甚遠(yuǎn)。我們第二部分中的結(jié)果初步提示,在無DPSCs移植情況下,SDF-1α可通過募集宿主細(xì)胞在牙根段內(nèi)生成富含血管和膠原的結(jié)締組織。本實驗旨在基于“干細(xì)胞歸巢”模式,進(jìn)一步探索建立SDF-1α介導(dǎo)的犬成熟恒牙原位牙髓再生模型,比較研究其再生組織與正常牙髓的形態(tài)特點以及自噬相關(guān)分子表達(dá)水平。 方法:選取比格犬根尖孔閉合恒牙,牙髓暴露法誘導(dǎo)根尖周炎,根管預(yù)備消毒后針扎根尖出血,移植入負(fù)載SDF-1α的絲素蛋白支架,以單純針扎出血誘導(dǎo)根管內(nèi)形成血凝塊為對照,建立成熟恒牙牙髓原位再生模型。HE、Masson三色法和苦味酸-天狼星紅染色分析再生組織形態(tài)特點;免疫組織化學(xué)染色進(jìn)一步檢測自噬相關(guān)分子LC3和Atg5的表達(dá)。 結(jié)果:在犬成熟恒牙原位牙髓再生模型中,血凝塊對照組和負(fù)載SDF-1α的絲素蛋白支架組根管內(nèi)均可見到組織形成,含部分炎性細(xì)胞。血凝塊對照組再生組織中主要為沿牙本質(zhì)壁形成的較厚的牙骨質(zhì)樣組織,髓腔內(nèi)有大小不一的骨樣組織及少量含有小血管的結(jié)締組織。負(fù)載SDF-1α的絲素蛋白支架組再生組織為牙髓樣組織,表現(xiàn)為血運較豐富的結(jié)締組織,膠原纖維排列方式與正常牙髓類似,髓腔內(nèi)未見骨樣組織,沿牙本質(zhì)壁形成較薄的礦化組織。而礦化組織表面可見排列均勻的單層細(xì)胞,并有纖維樣結(jié)構(gòu)深入其中。此外,在犬正常牙髓中,Atg5基本無表達(dá),LC3僅表達(dá)于成牙本質(zhì)細(xì)胞;而在再生組織中,Atg5和LC3均有表達(dá),且負(fù)載SDF-1α的絲素蛋白支架組表達(dá)水平高于血凝塊對照組。 結(jié)論:基于“干細(xì)胞歸巢”模式,絲素蛋白支架負(fù)載SDF-1α可有效實現(xiàn)原位牙髓再生,再生組織與正常牙髓類似,并伴隨自噬相關(guān)分子表達(dá)升高。本研究將為牙髓再生的臨床轉(zhuǎn)化提供依據(jù)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】:武漢大學(xué)
【學(xué)位級別】:博士
【學(xué)位授予年份】:2014
【分類號】:R781.3

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