本文選題：金納米棒　切入點：口腔癌　出處：《武漢大學》2014年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：研究背景： 口腔鱗狀細胞癌(oral squamous cell carcinoma, OSCC)是口腔頜面部最常見的惡性腫瘤,發(fā)病率占全身腫瘤的第六位,每年累及超過300,000人,五年生存率不超過50%。在美國,每年有超過35,000人被新診斷為口腔癌,在2008年就曾報道接近8,000人死于口腔癌。其惡性程度高,預后差,發(fā)病機制尚不清楚�？谇话┰谠缙诙鄡H表現(xiàn)為黏膜改變,例如潰瘍,白斑,紅斑等,病變面積小與其他黏膜疾病難以區(qū)分,而當癥狀真正引起病人注意時往往為時已晚。因此,延遲的診斷和治療是口腔癌的診斷率和存活率不能提高的主要原因。約60%的口腔癌被發(fā)現(xiàn)時已是晚期,約90%的口腔癌為鱗狀上皮細胞癌,且近年來有年輕化的趨勢。另一方面,相對于肝癌、肺癌等深部腫瘤,口腔癌位置表淺,因此及時發(fā)現(xiàn)和治療的可行性高。早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷、早期治療癌前病變是目前降低口腔鱗癌病死率的惟一途徑。 對此,本課題組致力于發(fā)現(xiàn)新的癌癥篩查方式,改善其生活質量及生存率。杜格非曾研究了孟加拉紅(Rose bengal, RB)染色對于口腔癌的篩查效果,通過病損部位涂布孟加拉紅,其診斷敏感性和特異性可達93.9%和73.7%,但RB對部分炎癥染色與癌癥染色難于區(qū)分。我組合作成員王佳宏等人通過螯合RB與納米金棒合成新材料,利用敏感的光學檢測提出新的口腔癌診斷思路,通過納米金棒的紅移現(xiàn)象,暗場成像等高新技術實現(xiàn)口腔癌細胞與正常上皮細胞的甄別,但僅為實驗室研究,同時臨床運用需要多種精密光學儀器,費用昂貴。在此基礎上,本課題結合前人篩查方法臨床要求的快捷簡便及光學診斷的靈敏等優(yōu)勢,旨在建立診斷效率更高且更具有臨床運用價值的口腔癌早期篩查系統(tǒng)早期檢測口腔癌,并通過探究口腔黏膜惡性改變機制,希望在減緩或遏制其惡性化轉變的同時,為以后尋找合適的口腔癌診斷的靶向分子打好基礎,最終能通過靶向分子的特異性診斷提高診斷效率,進一步提高口腔癌生存率。 活檢是癌癥臨床診斷的金標準,通過切取病變組織后由病理學家觀察微觀細胞形態(tài)改變得出診斷,因此需要經驗豐富的病理專家,主觀性強。此外活檢具有一定的侵入性,然而只有2%左右的黏膜改變可能轉化為癌癥,反復操作易對患者造成較大損傷,所以為了減少患者不必要的痛苦,我們希望能利用表面增強拉曼散射(surface-enhanced Raman scattering, SERS)實現(xiàn)少量組織或細胞拉曼信號收集,完成活檢前的篩查工作。而早期研究中,拉曼己經被成功用于腎癌,肝癌,肺癌,宮頸癌等各種癌癥的診斷。研究結果顯示對活檢切除的組織進行拉曼檢測,分析光譜數(shù)據(jù)后發(fā)現(xiàn)拉曼可很好的區(qū)分正常,炎癥,癌前及癌癥組織。但是生物樣本的拉曼信號通常較弱,需要大塊的活檢組織,而相對于活檢來說拉曼檢測仍然是不必要的,因此拉曼檢測在臨床的運用受到一定的限制。隨著科學研究發(fā)展,SERS利用納米金屬顆粒的SPR效應放大拉曼信號,僅僅需要收集少量細胞即可完成高敏篩查,再次使拉曼成為研究熱點。 早在單分子檢測應用中,SERS技術即可達到超高的分辨率,可完成超低濃度溶液或者超薄薄膜中分子的檢測。有研究人員報道能夠達到非常可觀的,即1014～1015的增強效果。因此近幾年,SERS技術引起了各領域相關科研人員的極大興趣。在生物化學領域,SERS光譜能夠反映蛋白質、核酸等生物大分子的結構和構象等信息,有助于揭示生命的奧秘。在醫(yī)學研究領域,SERS技術最大的特點就是無損,因此在水溶液樣品的分析和選擇性激發(fā)等方面具有得天獨厚的優(yōu)勢。Sequaris等首次報道了用SERS技術表征鉑的配合物與DNA的相互作用,此后很多科研小組都表示出濃厚的興趣,相繼開始了這方面的研究。研究者發(fā)現(xiàn)SERS可成功實現(xiàn)靈敏的檢測出基因變異,超敏檢測蛋白及RNA等。同時通過特異性分子標記后,靶向檢測特定蛋白,DNA, RNA等也已成功實現(xiàn),但是臨床實踐還有待進一步研究。同時有學者通過SERS探針實現(xiàn)了動物活體及活細胞的生物成像,完成生物過程的可視化。 因此本實驗第一個部分利用表面等離子納米貴金屬材料SERS效應來完成口腔癌的篩查�？谇话┎∽兌啾憩F(xiàn)為黏膜改變,與其他黏膜疾病難于區(qū)分,同時容易被忽略,另一方面口腔癌位置表淺,通過脫落細胞技術可以方便收集少量的細胞樣品,然后利用SERS的放大效應及拉曼檢查的快速無損性等特點,發(fā)明一種新的簡便的具有臨床意義的癌癥篩查系統(tǒng)。 本實驗第二個部分用于探究自噬在口腔癌發(fā)生發(fā)展中的早期變化。自噬是一種生物長期進化保留下來的生物過程,用于長壽命蛋白質及溶酶體,內質網(wǎng)等細胞器成分的降解與循環(huán)再利用,是真核細胞特有的生命現(xiàn)象。現(xiàn)已有大量研究表明自噬在多種癌癥發(fā)生發(fā)展中,例如肝癌,皮膚癌,胃癌等,中起到了重要作用。然而,其結果具有一定的矛盾性。在不同的刺激因素下,例如活性氧刺激自噬產生,抑制細胞增殖進而抑制腫瘤生長。Beclin1,是自噬前體形成的重要蛋白,能與Vps34,Vps15互相結合形成自噬前體。而抑制Beclin1蛋白可促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展。同時自噬是區(qū)別于凋亡,壞死等的一種程序性死亡過程,因而可以認為是腫瘤細胞死亡的過程。然而,在某些情況下自噬能促進腫瘤發(fā)展。一旦腫瘤形成,自噬可作為一種自我保護機制,為腫瘤生長提供能量,并抵抗放化療療效。因此,我們推斷,自噬對于腫瘤的功能影響可能是源于不同的條件。腫瘤種類不同及階段不同,自噬所起的作用都不盡相同。自噬相關蛋白在癌癥中可表現(xiàn)為低表達或過度表達,其介導的損傷緩解抑制腫瘤在癌前狀態(tài),同時在特定的狀態(tài)下促進腫瘤存活,有學者發(fā)現(xiàn)其表達與腫瘤預后及分期可能具有相關性。而口腔癌相關研究結果顯示約2-12%的口腔癌癌前病變(oral premalignant lesions, OPLs)發(fā)展為癌變,80%的口腔癌源于OPLs,但是有90%左右的OPLs不會惡變?yōu)榘┌Y,長期表現(xiàn)為紅白斑及口腔扁平苔蘚,因此對口腔癌前病變惡性轉化可能性的判斷,可有效減輕患者心理壓力,改善生活質量,但是自噬相關水平與口腔癌惡性程度轉化可能性是否相關? 目前己知自噬對癌癥病人分層意義重大,但對口腔癌自噬的研究較為稀缺,無法確定自噬在口腔癌中的表達高低與口腔癌預后等的關系等。所以,我們通過一個口腔癌發(fā)生發(fā)展模型來調查自噬的變化,并了解其在口腔癌早期惡性病變過程中的作用機制作為前期研究。后期仍需要更大量的實驗來完成自噬特異性分子的篩選,從而實現(xiàn)靶向SERS的口腔癌篩查。 實驗第一部分利用等離子納米顆粒,實現(xiàn)無適配子的SERS口腔癌篩查,在小樣本研究中對正常脫落細胞和癌癥脫落細胞的區(qū)分顯示較好靈敏度和特異性,但是針對癌癥與炎癥,癌前病變的甄別,針對惡性轉變幾率小和惡性轉變可能性大黏膜病損的甄別等更具有臨床意義,其重復性仍需要進一步檢驗。而自噬檢測在病人分層中具有重大意義,與癌癥預后復發(fā)率等關系莫大,可能實現(xiàn)目標。而口腔癌自噬相關研究較少。因此,我們希望能夠通過對口腔癌機制初探,為后期合適的癌癥篩查標記篩選打好基礎。最后,仍然需要大量的工作實行通過標記物與SERS的結合,利用SERS量化測量自噬水平,達到更好的篩查效果。 第一部分：一種基于SERS的非侵襲性等離子癌癥篩查方法 背景：SERS可以實現(xiàn)單分子水平的測量,因此可被運用于癌癥篩查。目的：利用SERS完成癌癥篩查,檢測該篩查方法的診斷靈敏度。方法：利用納米貴金屬顆粒表面等離子共振效應形成SERS,通過細胞脫落技術采集少量病變細胞,然后制作表面等離子基底,并利用SERS效應放大細胞信號,然后通過信號分析來篩查癌癥。而拉曼散射增強基底的制作是通過浸泡的方式及靜電結合原理,將納米金棒吸附到濾紙上面,形成可彎曲的三維的異質性拉曼基底。結果：正常細胞與癌癥細胞SERS光譜存在差異,揭示了癌癥特定生物分子的變化,包括癌細胞增加的核酸和蛋白質以及減少的脂質。為了區(qū)分20例正常脫落細胞和癌脫落細胞,峰值比算法I16001440, I14401340(1600和1440cm-1峰位峰值比,1440和1340cm-1峰位的峰值比)診斷靈敏度和特異性可達100%,而I14401340(1440和1340cm-1峰位峰值比)僅達到70%的靈敏度和60%的特異性。 結論：此方法操作簡便,迅速,經濟實惠,安全性高,診斷效率高,且具有非侵襲性,具有一定的臨床運用前景。同時此方法可以通過計算機分析進行自動化診斷,運用范圍廣泛,可能運用于全身各表皮癌癥的篩查,因此可成為臨床上癌癥篩查及診斷很好的輔助手段。 第二部分：自噬與口腔癌發(fā)生的關系 目的：觀察自噬在口腔癌發(fā)生發(fā)展中的變化,研究其在口腔上皮惡性改變發(fā)生發(fā)展中可能的作用及調控機制。方法：建立從健康上皮到口腔鱗狀細胞癌發(fā)生發(fā)展模型,在倉鼠左側頰囊涂布0.5%DMBA,分別在4周,8周,10周,13周時處死。通過免疫組化,免疫熒光及western blot的方法來觀察LC3,Beclin1,Bcl-2三個指標的表達。通過8-oHdG免疫組化結果來評估DNA損傷。結果：LC-3與Beclin1在4周時表達增加明顯(p0.05),但是在8周,10周,13周開始逐步減少。而Bcl-2表達持續(xù)增加,在13周時表達最多。而免疫熒光顯示Bcl-2與Beclin1的共定位在4周迅速達到高峰,而后逐步減少。同時8-OhdG在4周時表達增加較少,而在8周,10周,12周迅速增加。結論：自噬在癌癥發(fā)生發(fā)展中可能通過消除DNA損傷的方式來抑制癌癥發(fā)展,但是隨著刺激的持續(xù)增加,自噬清除DNA損傷的能力逐步下降,而自噬的耗竭可能加速上皮的惡變,因此可以通過對自噬的量化判斷其惡性轉化可能性。而自噬可能的調控機制可能受Beclin1與Bcl-2的共定位調節(jié)。
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【學位授予單位】：武漢大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R739.85

【參考文獻】

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本文編號：1577781