本文關(guān)鍵詞： 骨組織工程 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 支架材料 量效關(guān)系 自體濃縮骨髓血　出處：《北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院》2014年博士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】：目的 1.比較三種支架材料β-磷酸三鈣(p-TCP)、珊瑚羥基磷灰石(CHA)、凍干同種異體骨(FDBA)對(duì)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(hBMSCs)體外生物學(xué)特性和體內(nèi)成骨骨量的影響。 2.研究不同數(shù)量hBMSCs細(xì)胞懸液復(fù)合β-TCP和CHA支架在體外的生物學(xué)特性和TEB體內(nèi)成骨情況,探討hBMSCs數(shù)量與TEB體內(nèi)成骨骨量之間的量效關(guān)系。 3.初步開(kāi)展應(yīng)用自體濃縮骨髓血復(fù)合β-TCP修復(fù)齒槽嵴裂的臨床個(gè)體化治療。 方法 1.應(yīng)用密度梯度離心結(jié)合貼壁法分離培養(yǎng)hBMSCs,并將hBMSCs向成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞方向誘導(dǎo)分化。流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)hBMSCs的表面標(biāo)志物。取P3代hBMSCs在體外構(gòu)建β-TCP/hBMSCs、CHA/hBMSCs、FDBA/hBMSCs細(xì)胞支架復(fù)合物,體外成骨誘導(dǎo)2周后植入裸鼠皮下。體外培養(yǎng)的不同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)hBMSCs在支架材料上的粘附、生長(zhǎng)、細(xì)胞活性、空間分布、基質(zhì)分泌和成骨相關(guān)基因的表達(dá)。術(shù)后3月取材,Micro-CT和組織學(xué)定量檢測(cè)各組的成骨骨量。 2.以β-TCP和CHA為支架材料,使用1μL hBMSCs細(xì)胞懸液,不同接種濃度(5×106/mL、10×106/mL、20×106/mL、30×106/mL、50×106/mL)構(gòu)建TEB,并在體外培養(yǎng)的不同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)hBMSCs在支架材料上的粘附、生長(zhǎng)、細(xì)胞活性、空間分布、基質(zhì)分泌和成骨相關(guān)基因的表達(dá)。體外成骨誘導(dǎo)2周后植入裸鼠皮下,術(shù)后3月取材,Micro-CT和組織學(xué)定量檢測(cè)各組TEB的成骨骨量。 3.檢測(cè)自體濃縮骨髓血的生物安全性,明確自體濃縮骨髓血修復(fù)骨缺損技術(shù)的適應(yīng)證、禁忌證及可能的風(fēng)險(xiǎn),制定臨床治療流程并通過(guò)倫理委員會(huì)、新技術(shù)委員會(huì)討論后,于2013年10月至2014年1月,經(jīng)患者本人或監(jiān)護(hù)人簽字同意后,全麻下抽取自體骨髓血,應(yīng)用密度梯度離心法濃縮骨髓血,復(fù)合β-TCP支架修復(fù)臨床齒槽嵴裂缺損7例,術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)(3月、6月、1年和2年)行X線(xiàn)和CT檢查評(píng)價(jià)骨缺損修復(fù)情況。 結(jié)果 1.hBMSCs在β-TCP組和CHA組的粘附、生長(zhǎng)、分布明顯優(yōu)于FDBA組,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；FDBA構(gòu)建的TEB植入體內(nèi)3月后無(wú)新骨生成;β-TCP和CHA構(gòu)建的TEB體內(nèi)后可見(jiàn)新骨生成,構(gòu)建成功率分別為3/4、4/4；成骨面積定量分析結(jié)果顯示p-TCP組成骨骨量明顯高于CHA組。 2.以p-TCP為支架構(gòu)建TEB,接種濃度為10×106/mL及以上濃度時(shí),hBMSCs在p-TCP支架上的生長(zhǎng)、活性、分布、基質(zhì)分泌和成骨分化無(wú)顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,但均顯著優(yōu)于5×106/mL組。5×106/mL組在體內(nèi)無(wú)新骨生成；接種濃度為10、20、30和50×106/mL組的TEB體內(nèi)構(gòu)建成功率分別為5/7、7/8、6/8和6/8。組織學(xué)和Micro-CT定量分析顯示30和50×106/mL組TEB的成骨骨量明顯高于10和20×106/mL組。因此,采用支架飽和體積(10μL)接種時(shí),TEB達(dá)到穩(wěn)定構(gòu)建成功率所需的接種濃度是10×106/mL；TEB達(dá)到穩(wěn)定高效成骨的接種濃度是30x106/mL。 3.以CHA為支架構(gòu)建TEB,接種濃度10×106/mL及以上濃度時(shí),hBMSCs在β-TCP支架上的生長(zhǎng)、活性、分布、基質(zhì)分泌和成骨分化無(wú)顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,且明顯優(yōu)于10×106/mL組,10×106/mL組又明顯優(yōu)于5×106/mL組。體內(nèi)TEB樣本HE染色結(jié)果顯示：5×106/mL組無(wú)新骨生成；10、20、30和50×106/mL組的TEB體內(nèi)構(gòu)建成功率分別為7/8、4/7、6/8和6/8。成骨面積和Micro-CT定量分析顯示20、30和50×106/mL組TEB的成骨骨量明顯高于10×106/mL組,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。因此,采用支架飽和體積(1μL)接種時(shí),構(gòu)建的TEB達(dá)到穩(wěn)定構(gòu)建成功率所需的接種濃度是10×106/mL；TEB達(dá)到穩(wěn)定高效成骨的接種濃度是20×106/mL。 4.本臨床應(yīng)用研究共納入7例患者,其中男性2名,女性5名,年齡范圍8-27歲。截至2014年2月,全部患者術(shù)后均無(wú)感染、排斥、外露等并發(fā)癥出現(xiàn)；其中3名患者術(shù)后3月CT復(fù)查示骨缺損修復(fù)效果良好,其余4名患者仍在隨訪(fǎng)過(guò)程中。 結(jié)論 1.相較于FDBA,β-TCP和CHA支架更適合TEB的構(gòu)建。 2.hBMSCs數(shù)量與TEB成骨骨量之間存在量效關(guān)系：細(xì)胞接種數(shù)量低于該支架材料的最低細(xì)胞接種量時(shí),TEB植入體內(nèi)后不能成骨；TEB的成骨骨量隨細(xì)胞接種數(shù)量增加而增加,達(dá)到飽和接種量時(shí),TEB體內(nèi)穩(wěn)定高效成骨；超過(guò)飽和接種量時(shí),TEB成骨骨量無(wú)明顯增加。 3.hBMSCs飽和細(xì)胞接種量因支架材料的不同而不同,可能與支架材料本身的特性有關(guān)。 4.自體濃縮骨髓血復(fù)合β-TCP可修復(fù)臨床齒槽嵴裂。
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【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R783.1

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1554076