本文關鍵詞： 膠原支架 人牙髓干細胞 纖維內硅化 成骨分化 骨再生　出處：《第四軍醫(yī)大學》2014年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：腫瘤、骨質疏松、創(chuàng)傷、骨關節(jié)炎等多種原因導致的骨缺損一直嚴重影響著人們的健康和生活質量。盡管自體骨移植被認為是骨缺損的最佳修復方法，但是仍存在供體有限、手術創(chuàng)傷、并發(fā)癥較多、手術時間長等問題。而同種異體骨移植和異種骨移植，則由于免疫排斥、生物相容性較差等缺點，在臨床應用中受到了很大的限制。因此尋找理想的骨替代材料，成為了骨缺損修復面臨的重要難題。隨著研究的不斷進展，近年來基于干細胞的骨組織工程已在骨缺損修復材料的研制方面取得一系列重要的進展。 為了實現(xiàn)功能化骨的再生，組織工程三大關鍵要素即種子細胞、支架材料和生物活性因子的選擇和整合至關重要。雖然骨髓間充質干細胞具有良好的成骨分化潛能，并已經在骨組織的重建再生方面得到了廣泛的研究，然而細胞獲取困難、費用高昂、創(chuàng)傷較大等問題限制了其在臨床中的應用。與骨髓間充質干細胞相比，牙髓干細胞的獲取方法容易，獲取過程對患者造成的創(chuàng)傷和經濟負擔小，具有更高的克隆形成能力，并且已有研究表明牙髓干細胞能夠分化為成骨細胞并形成骨組織，因此牙髓干細胞有望替代骨髓間充質干細胞，成為骨組織工程中理想的自體種子細胞。 除種子細胞以外，支架材料是骨組織工程的又一重要因素，常見的支架材料有金屬、陶瓷、天然聚合物和合成聚合物等，然而現(xiàn)有的材料仍無法滿足理想組織工程支架材料的要求。I型膠原為骨細胞外基質的主要有機成分，具有良好的生物相容性，是骨組織工程中常用的支架材料，但是易降解和機械性能較差等問題成為其應用的掣肘。為了解決這一問題，本課題組在前期研究中在國際上首次實現(xiàn)了重組I型膠原支架的纖維內硅化，顯著提高了膠原支架的機械性能和耐酶解性，并且證實該支架材料能夠促進骨髓間充質干細胞的成骨分化，，顯示了其在骨缺損修復領域的應用前景。 然而纖維內硅化膠原是否能促進牙髓干細胞的成骨分化，其分化特征如何，目前仍不清楚。因此本研究的目的是探索纖維內硅化膠原對牙髓干細胞成骨分化的影響，從而為纖維內硅化膠原和牙髓干細胞在骨組織工程中的應用提供實驗基礎。 主要實驗內容及結果 1.纖維內硅化膠原對人牙髓干細胞活性的影響 從人牙髓中分離牙髓干細胞，通過細胞形態(tài)、克隆形成能力、干細胞表面標志物等方面對細胞干性進行鑒定；通過掃描電子顯微鏡（scanning electron microscopy，SEM）觀察細胞生長情況和Propidium iodide檢測細胞凋亡壞死情況，評估纖維內硅化膠原對細胞粘附、伸展及細胞凋亡壞死特性的影響；通過細胞周期實驗和脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）含量測定實驗，檢測纖維內硅化膠原對人牙髓干細胞增殖特性的影響。結果表明所分離培養(yǎng)的人牙髓干細胞為成纖維樣細胞，克隆形成率為25%，間充質干細胞的表面標志物CD29、CD44、CD90和CD105的表達為陽性，造血干細胞的表面標志物CD34和CD45的表達為陰性；纖維內硅化膠原組、未硅化膠原組和空白對照組中正常人牙髓干細胞所占百分比無統(tǒng)計學差異（p＞0.05）；纖維內硅化膠原組中人牙髓干細胞的DNA含量和S期細胞百分比均明顯高于未硅化膠原組和空白對照組（p＜0.05）。 2.纖維內硅化膠原促進人牙髓干細胞成骨分化的體外實驗研究 通過實時定量聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）、蛋白免疫印跡、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）染色、ALP活性檢測、茜素紅染色和馮庫薩染色，從多個角度評估纖維內硅化膠原對人牙髓干細胞成骨分化的影響。結果表明，與未硅化膠原組和陰性對照組相比，纖維內硅化膠原組中的成骨標志基因和蛋白成骨特異性轉錄因子（runt-related transcription factor2，RUNX2）、成骨相關轉錄因子（osterix，OSX）、骨鈣素（osteocalcin，OCN）、骨橋蛋白（osteopontin，OPN）、ALP和I型膠原（type I collagen，COLI）的表達水平均明顯增高（p＜0.05）；纖維內硅化膠原組中人牙髓干細胞內ALP活性及礦化沉淀形成量明顯高于未硅化膠原組和陰性對照組（p＜0.05）。 3.纖維內硅化膠原促進人牙髓干細胞成骨分化的體內實驗研究 分別構建人牙髓干細胞與纖維內硅化膠原及未硅化膠原的復合體，將各組細胞-支架復合體植入裸鼠皮下，8周后，進行伊紅和蘇木精（hemotoxylin and eosin，HE）染色、茜素紅染色、馮庫薩染色和免疫組織化學染色，觀察骨樣組織的形成情況。結果表明，纖維內硅化膠原組中骨細胞、血管和骨樣組織的形成均明顯多于未硅化膠原組和陰性對照組（p＜0.05）；纖維內硅化膠原組中礦化沉淀形成的量和成骨標志蛋白OCN的表達水平均明顯高于未硅化膠原組和陰性對照組（p＜0.05）。 綜上所述，纖維內硅化膠原支架具有良好的生物相容性，與普通膠原支架相比，能夠明顯促進人牙髓干細胞的增殖、成骨分化和礦化，該支架材料與人牙髓干細胞復合后能夠在動物體內取得良好的成骨效果。纖維內硅化膠原和人牙髓干細胞的聯(lián)合應用有望為臨床骨缺損的修復治療提供一種新的選擇。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R783.3

【共引文獻】

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