本文關(guān)鍵詞：高壓氧促進(jìn)炎性髁突軟骨細(xì)胞外基質(zhì)表達(dá)作用的研究　出處：《山東大學(xué)》2016年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：目的：探討高壓氧調(diào)節(jié)P13K/AKT信號(hào)通路促進(jìn)炎性髁突軟骨細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞外基質(zhì)的作用。方法：體外培養(yǎng)3-4周SD大鼠髁突軟骨細(xì)胞。在無(wú)菌環(huán)境下,取雙側(cè)髁突,以含有雙抗的磷酸鹽緩沖液(PBS)沖刷并剝離軟骨,反復(fù)剪切至1mm3大小,首先在37℃環(huán)境下用0.25%濃度的胰蛋白酶消化30分鐘,然后37℃振蕩加入濃度為0.2%的Ⅱ型膠原酶,1-2小時(shí)消化完后、分離原代軟骨細(xì)胞并培養(yǎng),通過(guò)倒置顯微鏡每天觀測(cè)原代軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)、形態(tài)變化,并用細(xì)胞形態(tài)學(xué)、Ⅱ型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)染色、Ⅱ型膠原免疫熒光染色鑒定培養(yǎng)結(jié)果。隨機(jī)將第2代處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期髁突軟骨細(xì)胞分為四組,分別用0、0.1、1、10ng/ml IL-1β處理24小時(shí),對(duì)各組之間Ⅱ型膠原、AGG蛋白和ⅠnRNA表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè),并篩選出能造成髁突軟骨細(xì)胞炎性狀態(tài)的IL-1β最佳濃度；取第2代處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期髁突軟骨細(xì)胞隨機(jī)分為四組：對(duì)照組,細(xì)胞不做任何處理；IL-1β組,lOng/ml IL-1β處理24小時(shí)；HBO組,lOng/ml IL-1β處理24小時(shí)后HBO每天處理90分鐘,共四天。Inhibitor+HBO 組:10ng/ml IL-1β處理24小時(shí),提前一小時(shí)加入25uMLY294002(PI3K抑制劑)后HBO每天處理90分鐘,共四天。分別用CCK-8法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖活性；western blotting、免疫組化或者免疫熒光檢測(cè)各組之間collagen Ⅱ、AGG、PI3K 和 p-PI3K、AKT 和 p-AKT的蛋白表達(dá)量；qRT-PCR檢測(cè)各組collagen Ⅱ、AGG、PI3K 和 p-PI3K、AKT 和 p-AKT mRNA表達(dá)量。結(jié)果：(1)消化髁突,提取軟骨細(xì)胞接種,觀察見(jiàn)細(xì)胞呈形態(tài)規(guī)則、小球形。一天后,多數(shù)細(xì)胞貼附于培養(yǎng)瓶底,鏡下觀察可呈多角形；5天后,可觀察到“鋪路石”樣外觀,培養(yǎng)瓶底面被80%左右的細(xì)胞鋪滿。經(jīng)一次傳代后,細(xì)胞貼壁速度明顯加快,勻稱分布,當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)滿,再次傳代；據(jù)我們觀察在3代以內(nèi),軟骨細(xì)胞增殖速率快,在此以后,髁突軟骨細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形,出現(xiàn)“去極化”現(xiàn)象,生長(zhǎng)速度明顯變緩。胞漿內(nèi)可見(jiàn)有棕黃色顆粒和紅色熒光顆粒經(jīng)Ⅱ型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)和細(xì)胞免疫熒光染色。(2) 10ng/ml IL-1β降低髁突軟骨細(xì)胞Ⅱ型膠原和AGG表達(dá)的效果最明顯。(3)高壓氧干預(yù)炎性髁突軟骨細(xì)胞后,細(xì)胞增殖活性明顯增高,collagen Ⅱ、AGG, p-PI3K 和 p-Akt表達(dá)水平明顯升高；高壓氧干預(yù)并加入PI3K抑制劑后,髁突軟骨細(xì)胞增殖活性降低,collagen Ⅱ、AGG、p-PI3K和p-Akt表達(dá)水平下降。結(jié)論：高壓氧通過(guò)PI3K/Akt通路促進(jìn)炎性髁突軟骨細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞外基質(zhì)、升高軟骨細(xì)胞的增殖活性,為臨床治療TMJ-OA提供新方式。
[Abstract]:Objective: to investigate the role of hyperbaric oxygen in regulating P13K / AKT signaling pathway to promote the expression of extracellular matrix in inflammatory condylar chondrocytes. Condylar chondrocytes of SD rats were cultured in vitro for 3-4 weeks. The condyle of both sides was taken and washed with phosphate buffer solution (PBS) containing double antibodies. The cartilage was repeatedly cut to the size of 1mm3. At 37 鈩，

本文編號(hào)：1362016