本文關(guān)鍵詞：富血小板纖維蛋白凝膠作為牙髓再生支架的體外實(shí)驗(yàn)研究

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【摘要】：目的：通過體外分析富血小板纖維蛋白(plate-rich fibrin, PRF)凝膠的三維結(jié)構(gòu)及其生長因子的釋放規(guī)律、評價(jià)不同濃度PRF凝膠析出液對人牙髓細(xì)胞(human dental pulp cells, hDPCs)增殖的影響、探索PRF-hDPCs復(fù)合體制備方法,評估PRF凝膠作為牙髓組織再生支架的可行性。方法：1.實(shí)驗(yàn)一：采用Choukroun一步離心法制備PRF凝膠分別行組織學(xué)和掃描電鏡(scanning electron microscope, SEM)觀察。將PRF凝膠(PRF組)、PRF凝膠上半部分(PRF upper組)、PRF凝膠下半部分(PRF lower組)分別浸泡于DMEM培養(yǎng)基中,于24 h、72h、120 h、168 h、216 h收集析出液。通過酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)測定各組PRF凝膠釋放PDGF-BB、TGFβ1、IGF1、FGF2的濃度。2.實(shí)驗(yàn)二：采用組織塊法進(jìn)行hDPCs體外分離培養(yǎng),免疫組織化學(xué)染色法檢測波形絲蛋白、角蛋白的表達(dá)。將新鮮制備的PRF凝膠浸泡于DMEM培養(yǎng)基中,于第7天取析出液。分別用含PRF凝膠析出液濃度(體積分?jǐn)?shù))為25%(1PRF組)和75%(3PRF組)的條件培養(yǎng)基培養(yǎng)hDPCs。采用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(cell counting kit-8, CCK-8)檢測24 h、48 h、72 h、96 h、120 h、144 h、168 h各時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞增殖活性。3.實(shí)驗(yàn)三：分離培養(yǎng)hDPCs。用Choukroun一步離心法制備PRF凝膠。取PRF凝膠制備過程中的不同時(shí)間點(diǎn),即離心前、離心后立即和離心后10min,分別于離心管血液中加入hDPCs混懸液,制備hDPCs-PRF復(fù)合體。將復(fù)合后的hDPCs-PRF分別行組織學(xué)和SEM觀察。采用免疫組織化學(xué)染色鑒定細(xì)胞來源。將使用上述方法復(fù)合后的hDPCs-PRF置入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),7天后固定行H-E染色。結(jié)果：1.組織學(xué)觀察結(jié)果表明PRF凝膠由纖維蛋白基質(zhì)、白膜層及下端粘連的少量紅細(xì)胞三部分構(gòu)成,白細(xì)胞主要分布于白膜層底部,SEM顯示白膜層由粗大而密集的纖維條索構(gòu)成。ELISA結(jié)果表明,PRF凝膠可緩慢釋放一定量的PDGF-BB、TGFβ1、FGF2、IGF1,在大多數(shù)時(shí)間點(diǎn)PRF lower組生長因子釋放量高于PRF組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),而PRF upper組幾乎不釋放生長因子。2.CCK-8結(jié)果顯示,在24 h、48 h、72h、96 h, 1PRF組和3PRF組的光密度值與對照組相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；在120 h、144 h、168 h,1PRF組和3PRF組的光密度值高于對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);1PRF組的光密度值和3PRF組相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。3.在離心前組,組織學(xué)和SEM可見PRF凝膠內(nèi)有體積大于正常血細(xì)胞且形狀不規(guī)則的細(xì)胞分布于白膜層,該細(xì)胞呈波形絲蛋白陽性,CD45和CD68陰性表達(dá)；培養(yǎng)7天后,H-E染色可見PRF凝膠內(nèi)有長梭形細(xì)胞的集落形成,部分梭形細(xì)胞沿著白膜層和纖維蛋白凝膠的交界分布。在離心后和離心后10分鐘組,組織學(xué)和SEM均未發(fā)現(xiàn)有上述細(xì)胞存在于PRF凝膠。結(jié)論：1.PRF凝膠由纖維蛋白基質(zhì)、白膜層及下端粘連的少量紅細(xì)胞三部分構(gòu)成,可作為生長因子緩釋系統(tǒng)；2.PRF凝膠析出液可促進(jìn)hDPCs體外增殖；3.在PRF凝膠制備過程中,離心前往血液中加入hDPCs混懸液可將hDPCs嵌合到PRF凝膠的白膜層中,并且hDPCs在PRF凝膠支架中生長狀況良好。4.PRF凝膠有望成為牙髓再生良好的支架材料。
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R783.1

【參考文獻(xiàn)】

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1 Sibel Yildirim;Susan Y. Fu;Keith Kim;Chang Hun Lee;Sahng Gyoon Kim;Jeremy J. Mao;;Tooth regeneration: a revolution in stomatology and evolution in regenerative medicine[J];International Journal of Oral Science;2011年03期

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本文編號：1298821