本文關(guān)鍵詞：非綜合征唇腭裂的MSX1和IRF6基因突變研究

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【摘要】：研究目的先天性唇腭裂(orofacial cleft, OFC)是口腔臨床最常見的先天發(fā)育缺陷,其發(fā)病率大約為千分之一至千分之二。唇腭裂患者都存在面部美觀、功能甚至心理等一系列問(wèn)題,這些患者往往需要序列治療,包括外科手術(shù)、口腔正畸、語(yǔ)言訓(xùn)練及心理治療等,由此產(chǎn)生了一系列家庭及社會(huì)問(wèn)題。因此,研究唇腭裂的病因機(jī)制,不僅有助于從根本上理解唇腭裂的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程,也能給臨床的病因診斷及遺傳咨詢帶來(lái)巨大的幫助,有著很重大的社會(huì)意義。根據(jù)是否合并其他器官的改變,唇腭裂可分為綜合征唇腭裂(syndromic cleft lip with or without cleft palate, SCL/P)及非綜合征性唇腭裂(non-syndromic cleft lip with or without cleft palate, NSCL/P)兩種。非綜合征性唇腭裂占唇腭裂總數(shù)的70%,包括單純唇裂(cleft lip, CL)、單純腭裂(cleft palate, CP)、唇裂伴腭裂(cleft lip and palate, CLP)。綜合征唇腭裂的致病基因往往比較明確,大多為單基因遺傳病,而非綜合征唇腭裂的致病因素相對(duì)復(fù)雜,研究非綜合征唇腭裂可以更好的理解唇腭裂的發(fā)病機(jī)制。本研究是對(duì)山東地區(qū)非綜合征唇腭裂患者進(jìn)行收集,采樣,并從外周血白細(xì)胞中提取基因組DNA,利用分子遺傳學(xué)技術(shù),對(duì)臨床收集的非綜合征唇腭裂患者進(jìn)行MSXl基因和IRF6基因突變檢測(cè),尋找MSXl基因和IRF6基因突變攜帶者,進(jìn)行突變基因型的生物信息學(xué)分析,探索MSXl基因和IRF6基因突變與非綜合征唇腭裂的關(guān)系。研究方法首先進(jìn)行病例和對(duì)照人群的資料和DNA收集。收集臨床病例標(biāo)準(zhǔn)：2013-2015年,在山東大學(xué)第二醫(yī)院進(jìn)行唇腭裂治療的患者,選擇符合以下條件者：1)唇腭裂患者；2)不伴發(fā)其他系統(tǒng)器官畸形。在患者或監(jiān)護(hù)人知情同意的基礎(chǔ)上,納入作為研究對(duì)象。收集正常對(duì)照選取標(biāo)準(zhǔn)：1)無(wú)唇腭裂病史；2)其他器官無(wú)發(fā)育異常。在本人或監(jiān)護(hù)人知情同意的基礎(chǔ)上,納入本研究。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容包括：1)抽取患者及部分家系成員的外周靜脈血2m1/人,另抽取正常人外周靜脈血208份。EDTA抗凝,-70℃保存?zhèn)溆�。采用全血基因組DNA試劑盒提取基因組DNA；2)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增MSXl和IRF6基因的全部外顯子區(qū)域,將產(chǎn)物直接進(jìn)行測(cè)序；3)從NCBI-Homologene數(shù)據(jù)庫(kù)中提取人MSX1和IRF6蛋白的同源序列,將人MSX1蛋白(NP 002439.2)和9種脊椎動(dòng)物的Msx1蛋白(NP_001182191.1, XP_001118871.2, XP_545946.2, NP_777223.1, NP_034965.2, NP_112321.1, NP_990819.1, NP_571348.1 NP_001032329.1)進(jìn)行比對(duì),從NCBI-Homologene數(shù)據(jù)庫(kù)中提取人IRF6蛋白的同源序列。將人IRF6蛋白(NP 006138.1)和9種脊椎動(dòng)物的Irf6蛋白(XP_514168.2, XP_001110321.1, XP_005622392.1, NP_001070402.1, NP_058547.2, NP_001102329.1, XP_417990.4, NP_956892.1和NP 001025493.1)進(jìn)行比對(duì),利用ClustalW2軟件分析氨基酸的保守性；4)從NCB I-Homologene數(shù)據(jù)庫(kù)中提取人MSX1蛋白的同源序列,運(yùn)用ClustalX2.0.12程序?qū)@些蛋白序列進(jìn)行了多重比較,并且利用PsiPred 3.0程序?qū)θ薓SX1的2D結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)；從NCBI-Homologene數(shù)據(jù)庫(kù)中提取人IRF6蛋白的同源序列。運(yùn)用ClustalX2.0.12程序?qū)@些蛋白序列進(jìn)行了多重比較,并且并且在線網(wǎng)站PredictProtein (http://www.predictprotein)的2D結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)：5)運(yùn)用ClustalX2.0.12程序?qū)@些蛋白序列進(jìn)行了多重比較。利用在線網(wǎng)站(http://weblogo.berkeley.edu/logo.cgi)分析MSX1蛋白序列和IRF6蛋白保守性；6)利用在線軟件Phyre (www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre/)根據(jù)氨基酸序列一級(jí)保守性和已知蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)野生型和突變型IRF6蛋白的三維結(jié)構(gòu),并使用PyMOL軟件輸出圖像。研究結(jié)果在54例非綜合征性唇腭裂患兒中完成了MSX1和IRF6基因突變篩查。在編號(hào)13#患者中發(fā)現(xiàn)了MSX1基因第二外顯子上的一個(gè)錯(cuò)義突變(c.492CG; p.Cys164Trp).先證者性別男,年齡1歲,單純型唇裂,父母表型正常,沒(méi)有唇腭裂家族史。在發(fā)現(xiàn)患兒存在MSX1基因突變后我們對(duì)父母追加了MSX1突變檢測(cè),父母基因型與正常人一致。檢測(cè)到的突變位于cDNA序列的492位,編碼的氨基酸為半胱氨酸(Cys),患者該位點(diǎn)存在一個(gè)雜合的點(diǎn)突變,堿基由C變?yōu)镚,編碼的氨基酸變成色氨酸(Trp)。將人MSX1蛋白(NP 002439.2)和9種脊椎動(dòng)物(P.troglodytes, M.mulatta、 C.lupus, B.taurus, M.musculus, R.norvegicus, G.gallus, D.rerio和X.tropicalis)的Msx1蛋白(NP_001182191.1, XP_001118871.2, XP_545946.2, NP_777223.1, NP_034965.2, NP_12321.1, NP_990819.1, NP_571348.1和NP_001032329.1)進(jìn)行比對(duì),結(jié)果顯示164位點(diǎn)的氨基酸Cys在生物進(jìn)化過(guò)程中高度保守,提示該位點(diǎn)的突變可能導(dǎo)致氨基酸功能的改變。蛋白質(zhì)二維結(jié)構(gòu)分析顯示,164Cys在為高度保守殘基,位于保守的2D片段。這個(gè)殘基的突變會(huì)影響人類MSX1蛋白質(zhì)的功能。其中,p.Cys164Trp這一突變由半胱氨酸替換為色氨酸,半胱氨酸為一含有側(cè)鏈的羥基氨基酸,這一突變可能會(huì)消除164Cys與鄰近殘基的靜電作用,由帶電殘基轉(zhuǎn)變?yōu)橹行詺埢?帶電性質(zhì)的改變會(huì)嚴(yán)重影響蛋白的活性；另外半胱氨酸為親水基團(tuán)而色氨酸是疏水基團(tuán),親疏水性質(zhì)的改變會(huì)影響蛋白的活性。Weblogo分析顯示在MSX1蛋白第164位堆棧只有C(Cys),表示該位點(diǎn)高度保守,提示我們?cè)撐稽c(diǎn)的突變可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)功能的改變。在54例非綜合征性唇腭裂患兒中完成了IRF6基因測(cè)序,在一例散發(fā)性患兒中發(fā)現(xiàn)了IRF6基因的一個(gè)無(wú)義突變。研究編號(hào)40#,性別男,年齡1.5歲,單純型腭裂�；純菏巧l(fā)病例,沒(méi)有獲得親生父母的DNA,家族史不詳。測(cè)序結(jié)果與正常人基因組IRF6序列和對(duì)照組序列進(jìn)行比對(duì),顯示IRF6基因第9外顯子上的一個(gè)無(wú)義突變,可以導(dǎo)致IRF6蛋白在440位置終止(c.1320CG；p.Tyr440X).將人IRF6蛋白(NP_006138.1)和9種脊椎動(dòng)物的(P.troglodytes, M.mulatta, C.lupus. B.taurus, M.musculus, R.norvegicus, G.gallus, D.rerio和X.tropicalis)的Irf6蛋白(XP_514168.2, XP_001110321.1, XP_005622392.1, NP_001070402.1, NP_058547.2, NP_001102329.1 XP_417990.4, NP_956892.1和NP_001025493.1)進(jìn)行比對(duì),結(jié)果顯示440位點(diǎn)的氨基酸之后的序列高度保守,提示該改變對(duì)蛋白質(zhì)功能影響較大。蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示,截短的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,提示突變以后對(duì)蛋白質(zhì)功能有一定影響。Weblogo分析顯示在IRF6蛋白第440位堆棧只有Y(Tyr),表示該位點(diǎn)高度保守,提示我們?cè)撐稽c(diǎn)的突變可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)功能的改變。蛋白三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示截短的突變型IRF6蛋白三維結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,并形成了α-螺旋減少,對(duì)蛋白質(zhì)功能造成了影響。研究結(jié)論本研究針對(duì)臨床收集到山東地區(qū)的先天性非綜合征性唇腭裂病例,主要從致病基因的突變檢測(cè)入手,進(jìn)行分子病因?qū)W研究,以探索基因型和唇腭裂的相關(guān)性。本研究的第一部分通過(guò)對(duì)非綜合征性唇腭裂的MSXl基因的突變檢測(cè)和生物信息學(xué)分析,研究患者的致病基因和突變類型,以明確MSX1基因突變與臨床表型之間的相關(guān)性。本研究的第二部分通過(guò)對(duì)非綜合征性唇腭裂的IRF6基因的突變檢測(cè)和生物信息學(xué)分析,研究患者的致病基因和突變類型,以明確IRF6基因突變與臨床表型之間的相關(guān)性。以上研究得到如下結(jié)論：1、通過(guò)對(duì)臨床收集的非綜合征性唇腭裂患者M(jìn)SX1基因篩查檢測(cè),發(fā)現(xiàn)了一個(gè)可能導(dǎo)致非綜合征性唇腭裂的錯(cuò)義突變。(1).在編號(hào)13#患者中發(fā)現(xiàn)了MSXl基因第二外顯子上的一個(gè)錯(cuò)義突變(c.492G; p.Cysl64Trp)。檢測(cè)到的突變位于cDNA序列的492位,編碼的氨基酸為半胱氨酸(Cys),患者該位點(diǎn)存在一個(gè)雜合的點(diǎn)突變,堿基由C變?yōu)镚,編碼的氨基酸變成色氨酸(Trp)。先證者的父母不存在此突變類型,該突變?yōu)樾律蛔�。目前�?guó)內(nèi)并沒(méi)有關(guān)于MSX1突變可以導(dǎo)致非綜合征唇腭裂的發(fā)生報(bào)道,本研究是首次在中國(guó)人群非綜合征性唇腭裂患者中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)MSXl基因突變。(2).對(duì)該位點(diǎn)進(jìn)行生物信息學(xué)分析,顯示該位點(diǎn)在生物進(jìn)化過(guò)程中高度保守,突變可能影響蛋白質(zhì)功能。將人MSX1蛋白和9種脊椎動(dòng)物的Msx1蛋白進(jìn)行比對(duì),結(jié)果顯示164位點(diǎn)的氨基酸Cys在生物進(jìn)化過(guò)程中高度保守,Weblogo分析顯示在MSX1蛋白第164位堆棧只有C(Cys),表示該位點(diǎn)高度保守。蛋白質(zhì)二維結(jié)構(gòu)分析顯示,164Cys在為高度保守殘基,位于保守的2D片段。這個(gè)殘基的突變會(huì)影響人類MSX1蛋白質(zhì)的功能。以上研究都提示我們?cè)撐稽c(diǎn)的突變可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)功能的改變。2、通過(guò)對(duì)臨床收集的非綜合征性唇腭裂患者IRF6基因篩查檢測(cè),發(fā)現(xiàn)了一個(gè)可能導(dǎo)致非綜合征性唇腭裂的無(wú)義突變。(1).在54例非綜合征患兒中完成了IRF6基因測(cè)序,在一例散發(fā)性患兒中發(fā)現(xiàn)了IRF6基因的一個(gè)無(wú)義突變。患兒是散發(fā)病例,沒(méi)有獲得親生父母的DNA,家族史不詳。測(cè)序結(jié)果與正常人基因組IRF6序列和對(duì)照組序列進(jìn)行比對(duì),顯示IRF6基因第9外顯子上的一個(gè)無(wú)義突變,可以導(dǎo)致IRF6蛋白在440位置終止(c.1320CG；p.Tyr440X)。目前國(guó)內(nèi)外已經(jīng)有關(guān)于IRF6突變可以導(dǎo)致非綜合征唇腭裂的報(bào)道,本研究首次報(bào)道了IRF6上的一個(gè)新的突變,有助于擴(kuò)大IRF6突變的表達(dá)譜,為深入理解IRF6基因與非綜合征性唇腭裂的關(guān)系打下了一定基礎(chǔ)。(2).生物信息學(xué)分析顯示,該突變對(duì)蛋白質(zhì)功能及結(jié)構(gòu)都有較大影響。將人IRF6蛋白和9種脊椎動(dòng)物的的Irf6蛋白進(jìn)行比對(duì)并進(jìn)行Weblogo分析,結(jié)果顯示440位點(diǎn)的氨基酸之后的序列高度保守,蛋白質(zhì)二維和三維結(jié)構(gòu)分析也顯示突變蛋白截短后功能有一定改變。研究意義非綜合征性唇腭裂的致病基因一直是該領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。本研究通過(guò)對(duì)臨床收集到非綜合征性唇腭裂病例進(jìn)行致病基因的突變篩查,在中國(guó)人群中檢測(cè)到非綜合征性唇腭裂致病基因和新突變類型,并對(duì)突變蛋白進(jìn)行了生物信息學(xué)分析,進(jìn)一步驗(yàn)證了突變蛋白和非綜合征性唇腭裂的聯(lián)系。本研究在首次發(fā)現(xiàn)了MSXl和IRF6基因上的兩個(gè)新的突變類型,并進(jìn)行了生物信息學(xué)分析,不僅可以加深對(duì)此類疾病的認(rèn)識(shí),而且有利于更加全面深入地了解相關(guān)致病基因的結(jié)構(gòu)與功能,進(jìn)而為研究非綜合征性唇腭裂的分子機(jī)制提供線索,提高臨床預(yù)防和治療此類疾病的水平。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R782.2

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本文編號(hào)：1254696