發(fā)布時間：2017-11-20 06:12

  本文關(guān)鍵詞：周期性張應(yīng)力對人牙周膜細胞Periostin與Ⅰ型膠原表達的影響

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【摘要】：研究背景和目的：口腔正畸過程中,力學(xué)因素對牙周組織改建的影響貫穿了治療整個過程。人牙周膜細胞(hPDLCs)是人牙周組織的主要成分,是矯治力的直接效應(yīng)細胞,不僅合成了人牙周膜細胞外基質(zhì)中大多數(shù)的各型膠原纖維和蛋白多糖,而且還通過分泌和合成多種細胞因子與酶觸發(fā)多條胞外及胞內(nèi)信號傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò),共同參與調(diào)節(jié)牙周組織的代謝和改建。而hPDLCs如何將力學(xué)刺激信號轉(zhuǎn)化為細胞內(nèi)生化學(xué)信號,最終引起基因表達變化,而這一過程是如何進行的,其中涉及哪些信號通路有哪些相關(guān)基因表達,其確切機制一直是國內(nèi)外學(xué)者探索的前沿課題。以往研究表明許多細胞因子,激素和神經(jīng)肽等物質(zhì)通過局部或全身途徑影響牙周細胞來促進正畸牙的牙周組織改建。如何應(yīng)用細胞因子控制正畸牙移動,以達到縮短矯治療程,是當(dāng)前口腔正畸學(xué)基礎(chǔ)研究的熱點之一。Periostin(PN)屬成束蛋白(fasciclin)家族成員,分子量為90kD,主要由氨基末端(EMI域)、4個重復(fù)成束蛋白結(jié)構(gòu)域(fasl域)和羧基末端(C末端)構(gòu)成,在牙周膜和骨膜特異性表達。PN是一種力學(xué)敏感因子,在機械應(yīng)激導(dǎo)致的組織修復(fù)和再生,以及維護牙周組織的完整性、牙齒的發(fā)育以及萌出發(fā)揮著重要的作用。這提示PN可能在人正畸牙周組織改建扮演重要的角色,而目前PN僅僅限于嚙齒動物牙齒發(fā)育及萌出方面的體內(nèi)外試驗性研究而在正畸領(lǐng)域研究較少,從體外細胞基因和蛋白水平研究應(yīng)力下人牙周膜細胞PN的表達尚未見報道。因為PN與Ⅰ型膠原存在共同的分布區(qū)域,且可直接與Ⅰ型膠原結(jié)合,有研究發(fā)現(xiàn)PN基因剔除的小鼠膠原纖維的直徑減小,膠原交聯(lián)水平降低,這就提示了PN可調(diào)節(jié)Ⅰ型膠原纖維的合成,成為纖維結(jié)締組織的生物力學(xué)特性的重要介質(zhì)。Ⅰ型膠原作為人正畸牙牙周組織改建的最終產(chǎn)物之一,而PN可調(diào)節(jié)纖維形成和膠原蛋白的交聯(lián),因此,兩者有可能通過某種信號通路或多種信號通路交叉聯(lián)系。本實驗采用Flexcell-5000 Tension System應(yīng)力加載系統(tǒng)對體外培養(yǎng)的hPDLCs加載機械力,構(gòu)建細胞力學(xué)刺激模型,模擬正畸牙齒移動過程中的施力方式,從細胞基因水平和蛋白水平研究PN與Ⅰ型膠原在hPDLCs中的表達的情況,初步探討PN與Ⅰ型膠原在周期性張應(yīng)力引起的hPDLCs細胞力學(xué)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中的作用,有助于了解PN與Ⅰ型膠原之間的信號傳導(dǎo)通路,為進一步闡明牙周組織在正畸矯治力作用下的適應(yīng)性改建機理及機械力信號在細胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子機制提供理論依據(jù)。本論文主要包括以下兩部分內(nèi)容：第一部分hPDLCs體外培養(yǎng)-力學(xué)刺激模型的構(gòu)建目的：體外分離培養(yǎng)hPDLCs,通過觀察細胞形態(tài)特征,檢測其生長曲線,礦化能力并進行免疫組化鑒定。細胞加力后觀察細胞生長形態(tài)、排列及增殖情況,確定是否成功構(gòu)建力學(xué)刺激模型。方法：1.分離培養(yǎng)hPDLCs收集臨床新鮮拔除的牙周健康、無齲的智齒或正畸拔除牙,刮下根中1/3牙周膜組織,采用改良型組織化酶消化法培養(yǎng)。2. 倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)特征：利用MTT法檢測hPDLCs的生長增殖情況,繪制生長曲線；對細胞礦化誘導(dǎo)21d后,觀察礦化結(jié)節(jié)形成情況；通過免疫細胞化學(xué)方法檢測培養(yǎng)細胞的波形絲蛋白和角蛋白的表達,對hPDLCs來源進行初步鑒定。3.將第4-6代hPDLCs隨機分為4個實驗組和1個對照組。實驗組分為施加周期性張應(yīng)力6h、12h、24h、48h,以加力0h為對照組。4.周期性張應(yīng)力加載采用Flexcell FX-5000 Tension System應(yīng)力加載系統(tǒng),具體設(shè)置為：正弦波,形變10%,頻率0.5 Hz。加力后利用倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)、排列的情況。5.四唑鹽(MTT)比色試驗：在細胞加力6h、12h、24h、48h后,每孔加入5g/L的MTT 200ml,繼續(xù)培養(yǎng)4h,吸棄上清液,當(dāng)各組反應(yīng)完成后,每孔加入3m1二甲基亞砜(DMSO),充分振蕩10min,使結(jié)晶物充分溶解。用酶聯(lián)免疫檢測儀測定各孔細胞490nm波長的光吸收值(OD值)。結(jié)果：1. 改良型組織塊酶消化法分離培養(yǎng)hPDLCs,游出率和成活率較高。形態(tài)學(xué)觀察顯示：游出細胞多為梭形或星形。傳代細胞在24h后貼壁,貼壁后hPDLCs逐漸伸展為不規(guī)則圓形、多角形、梭形,呈放射狀或漩渦狀生長。2.細胞呈對數(shù)生長趨勢,曲線成倒S型,符合細胞生長規(guī)律；礦化誘導(dǎo)染色,鏡下可見散在紅色礦化結(jié)節(jié),具成骨能力；免疫細胞染色顯示波形絲蛋白染色細胞胞漿可見黃色顆粒,角蛋白染色細胞胞漿未見黃色顆粒；以上表明細胞取材于牙周膜組織,屬于中胚層來源細胞,且無上皮細胞的污染,證實是hPDLCs,可用于進一步的研究。3.加力后細胞形態(tài)排列的情況：細胞基本無脫落,生長狀態(tài)良好；實驗組細胞呈長梭形；細胞排列更加有序,由漩渦狀排列逐漸向柵欄狀平行生長,與加載牽張力的方向相一致。4.檢測加力后細胞增殖活性的MTT結(jié)果表明：與對照組比較,加力6h時細胞增殖活性降低,加力12h開始增強,加力24h增殖活性繼續(xù)增強達到本次實驗的峰值,而加力48h細胞增殖活明顯降低。5. hPDLCs體外培養(yǎng)-力學(xué)刺激模型成功構(gòu)建。第二部分 周期性張應(yīng)力對人牙周膜細胞Periostin與Ⅰ型膠原表達的影響目的：旨在了解體外培養(yǎng)的hPDLCs加載周期性張應(yīng)力后hPDLCs Periostin與Ⅰ型膠原表達的影響,初步探討PN與Ⅰ型膠原在應(yīng)力下hPDLCs細胞力學(xué)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中的作用。方法：1.本實驗將第4-6代hPDLCs隨機分為4個實驗組和1個對照組。實驗組分為施加周期性張應(yīng)力6h、12h、24h、48h,以加力0h即不加力為對照組。對實驗組加載形變10%,頻率0.5 Hz的周期性張應(yīng)力。2. qRT-PCR:使用Trizol提取牙周膜細胞的總RNA,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后,采用SYBR green法進行熒光定量實時PCR擴增,通過相對定量法計算2-△△Ct值,檢測PN與Ⅰ型膠原mRNA相對表達情況。3. Western blot:蛋白裂解液獲取細胞總蛋白,BCA法測定蛋白濃度, SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、抗體孵育、顯影及定影,檢測人牙周膜細胞PN蛋白的表達。用Quanlity one圖像分析系統(tǒng)軟件進行灰度值分析。4. 重復(fù)三次實驗所得結(jié)果應(yīng)用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計分析,對所測得的結(jié)果進行正態(tài)性及方差齊性檢驗。多組間比較采用單因素方差分析,若方差齊,組間比較則用LSD檢驗,方差不齊選用Dunnett's T3檢驗。檢驗水準為a=0.05,P0.05認為有顯著差異。結(jié)果：1. qRT-PCR結(jié)果顯示：PN mRNA的表達：在正常hPDLCs內(nèi)表達PN mRNA,加載張應(yīng)力6h后,PN mRNA表達降低(P0.05),而在加力12h后,表達開始增強,此后持續(xù)增強至加力24h達最高峰(P0.05),48h后開始下降恢復(fù)至不加力時的表達水平(P0.05)；Ⅰ型膠原mRNA的表達：與對照組相比,加載張應(yīng)力6h,12h后,Ⅰ型膠原mRNA表達無明顯改變,加力24h,表達開始增強,此后持續(xù)增強至加力48h達最高峰(P0.05)。2.經(jīng)Westernblot檢測：細胞加載張應(yīng)力6h時,PN蛋白表達明顯降低(P0.01),加力12h后PN蛋白表達開始逐漸升高,并持續(xù)到加力24h時,PN蛋白表達顯著增強,達到最高水平(P0.01)；而在加力48h時,PN蛋白表達開始下降,恢復(fù)至不加力時的表達水平(P0.05)。全文結(jié)論：1.改良型組織塊酶消化法能成功培養(yǎng)出hPDLCs,并成功構(gòu)建hPDLCs體外培養(yǎng)-力學(xué)刺激模型。2.在一定時間內(nèi)的周期性張應(yīng)力(形變率為10%,頻率為0.5Hz,波形為正弦波)加載可促進hPDLCs PN與Ⅰ型膠原表達,Ⅰ型膠原表達增強明顯晚于PN表達基因,兩者表達具有時序性,推測Ⅰ型膠原位于PN的下游發(fā)揮作用。3.周期性張應(yīng)力作用下,PN與Ⅰ型膠原參與了細胞機械應(yīng)力信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。4.PN與Ⅰ型膠原可能作為主要的調(diào)控因子參與正畸牙周組織的改建。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R783.5

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 ;Sputum interleukin-17 is increased and associated with airway neutrophilia in patients with severe asthma[J];Chinese Medical Journal;2005年11期

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本文編號：1206349