本文關鍵詞：分化轉錄相關因子Hey1在成牙本質(zhì)細胞樣細胞發(fā)生中的作用及其機制的初步研究

  更多相關文章： Notch信號通路 成牙本質(zhì)細胞 分化 骨形態(tài)形成蛋白2 hairy相關轉錄因子1

【摘要】：成牙本質(zhì)細胞是單層排列于牙髓組織最外層的高度分化細胞。成牙本質(zhì)細胞的主要功能是生成構成牙體硬組織最主要部分的牙本質(zhì)。當牙髓受到齲源相關性細菌刺激或者直接外力損傷等破壞時,相關部位的這些成牙本質(zhì)細胞可能死亡。然而這些損傷又能夠刺激成熟牙髓組織中的一些前體細胞分化成為一種“成牙本質(zhì)細胞樣細胞”,這種細胞和成牙本質(zhì)細胞的特性非常相似。成牙本質(zhì)細胞樣細胞的分化受到很多信號通路的調(diào)控,如TGF/smads、FGF、Wnt和Notch信號通路。在這些通路中,Notch信號通路被認為和細胞分化密切相關。Notch信號通路的下游分子Hey1,也可能參與成牙本質(zhì)細胞樣細胞的分化。Hey1(也被稱為Hesr1、HRT1或HERP2)是屬于HERP(hairy/Enhancer of split-related protein)家族的轉錄因子。HERP家族多為轉錄抑制物。Hey1被證明是Notch信號通路下游RBP-Jk的直接效應分子,其功能為細胞核效應器,并且在多種細胞分化過程中被證明是一個關鍵的轉錄因子。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)Hey1在牙髓組織中有表達,然而Hey1在成牙本質(zhì)細胞樣細胞分化過程中的作用和機制卻尚不清楚。在本課題的研究中,我們觀察了Hey1在OLC細胞系(odontoblast-lineage cell line)受到兩種分化誘導液——添加l-抗壞血酸(aa)、β-磷酸甘油(gp)和地塞米松(dex)的培養(yǎng)液以及添加rh-bmp2的培養(yǎng)液——刺激時的表達情況。之后將包含hey1編碼全長的質(zhì)粒和hey1shrna基因沉默的質(zhì)粒分別轉染入olc細胞系以構建hey1過表達及表達抑制的細胞系(分別命名為olc/hey1op和olc/hey1kd)。通過比較這些細胞系分化及礦化等能力之間的差異,探索hey1在成牙本質(zhì)細胞樣細胞分化過程中可能發(fā)揮的作用。本研究將有助于為hey1進一步應用于牙髓牙本質(zhì)再生或活髓保存治療提供新的思路。結果如下:1.hey1過表達對成牙本質(zhì)細胞樣細胞發(fā)生的影響將包含hey1編碼全長的真核表達質(zhì)粒pef-dest51-hey1轉染至olc細胞系,rt-pcr及western-blot驗證建立的olc/hey1op細胞系能夠穩(wěn)定過表達hey1。之后用以上兩種分化誘導液刺激細胞。發(fā)現(xiàn):olc/hey1op細胞中dspp、alp等礦化相關基因較正常olc細胞顯著上調(diào),western-blot及免疫熒光檢測dsp蛋白表達量也上調(diào)。olc/hey1op細胞在誘導后的alp分泌活性高于olc細胞,茜素紅s染色發(fā)現(xiàn)其礦化結節(jié)形成能力也較高。2.hey1基因抑制對成牙本質(zhì)細胞樣細胞發(fā)生的影響我們采用rna干擾的方法建立了hey1基因表達抑制的穩(wěn)定細胞系olc/hey1kd,定量pcr驗證表明olc/hey1kd中hey1表達顯著降低。與hey1過表達相反,我們發(fā)現(xiàn)hey1的缺失會下調(diào)分別經(jīng)過兩種分化誘導液刺激后細胞礦化相關基因的mrna水平。olc/hey1kd細胞受刺激后的alp分泌活性及形成礦化結節(jié)的能力也低于正常olc細胞。3.notch信號抑制劑對hey1在成牙本質(zhì)細胞樣細胞發(fā)生中作用的影響為了進一步研究hey1調(diào)節(jié)成牙本質(zhì)細胞樣細胞分化的功能是否由notch信號通路激活的,我們應用dapt抑制notch信號通路以觀察hey1以及olc細胞分化功能的改變。結果表明1μmol/ldapt能夠有效抑制olc細胞中hey1的表達。與預先設想不同的是,在aa+gp+dex誘導液刺激時dapt會提高olc細胞的分化能力,而在用rh-bmp2誘導液刺激時,olc細胞的分化能力則受到dapt抑制,而過表達Hey1的細胞能夠抵消這種抑制作用。這提示Hey1可能并不單是Notch信號通路的效應因子,也可能是不同信號通路之間互相作用的中間環(huán)節(jié)。
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R781

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本文編號：1146383