本文關(guān)鍵詞：GPNMB對體外人牙髓干細(xì)胞成牙本質(zhì)分化的作用研究

  更多相關(guān)文章： 牙髓干細(xì)胞 成牙本質(zhì)分化 細(xì)胞因子 GPNMB 細(xì)胞增殖

【摘要】：背景：牙髓在牙齒萌出以后的牙齒組織再生中起著極為重要的作用牙髓組織由外胚層間充質(zhì)組成,其中含有具有可塑性和多向分化潛能的神經(jīng)嵴源性間充質(zhì)祖細(xì)胞,即牙髓干細(xì)胞(DPSCs, dental pulp stem cells)。當(dāng)牙體組織受到創(chuàng)傷和不可逆性的齲病損害時,牙髓干細(xì)胞會分化成新的成牙本質(zhì)細(xì)胞分泌牙本質(zhì)基質(zhì),即形成所謂的修復(fù)性牙本質(zhì)。從人類健康的阻生第三磨牙可輕易獲得具有增殖潛能的牙髓干細(xì)胞,并且在特定條件下可以誘導(dǎo)表現(xiàn)為多能干細(xì)胞特點(diǎn)。在體外特定條件下,培養(yǎng)的牙髓干細(xì)胞具有分化成為成牙本質(zhì)樣細(xì)胞的能力,表現(xiàn)為高的克隆能力、增殖能力和形成致密鈣化克隆團(tuán)甚至是鈣化結(jié)節(jié)的能力。因此,研究認(rèn)為牙髓干細(xì)胞可應(yīng)用于牙體組織再生領(lǐng)域。牙齒的再生是由一個復(fù)雜的過程,眾多的細(xì)胞因子參與了該過程的調(diào)控�？缒し寝D(zhuǎn)移性黑色素瘤糖蛋白B (GPNMB, Glycoprotein (transmembrane) nonmetastatic melanoma protein b)是骨組織形成中的重要細(xì)胞因子。研究發(fā)現(xiàn),作為骨誘導(dǎo)因子,GPNMB可以促進(jìn)骨組織形成和成骨細(xì)胞的分化。那么,GPNMB是否參與了調(diào)控牙髓干細(xì)胞成牙本質(zhì)分化過程尚不清楚；如果GPNMB參與了調(diào)控牙髓干細(xì)胞成牙本質(zhì)分化過程,其作用尚不明確。目的：本研究首先分離、培養(yǎng)及鑒定人牙髓干細(xì)胞；在此基礎(chǔ)上,探討人牙髓干細(xì)胞體外誘導(dǎo)成牙本質(zhì)分化后GPNMB的表達(dá)；然后對牙髓干細(xì)胞轉(zhuǎn)染敲除GPNMB基因的siRNA,檢測GPNMB mRNA和蛋白表達(dá)和增殖能力以及礦化誘導(dǎo)后牙髓干細(xì)胞的ALP活性和礦化相關(guān)基因(DSPP和DMP-1)的表達(dá),探討GPNMB在牙髓干細(xì)胞體外成牙本質(zhì)分化的作用。從而為將來探討GPNMB在DPSCs成牙本質(zhì)分化中的分子學(xué)機(jī)制及牙體牙髓損傷后修復(fù)和牙組織工程技術(shù)研究奠定分子生物學(xué)基礎(chǔ)。材料和方法：1.應(yīng)用酶組織塊消化法從成人阻生的健康第三磨牙中分離獲得牙髓干細(xì)胞,并應(yīng)用有限稀釋法對牙髓干細(xì)胞進(jìn)行分離、培養(yǎng),經(jīng)細(xì)胞克隆形成實驗評價其細(xì)胞克隆能力,經(jīng)礦化誘導(dǎo)后ALP定量、茜素紅染色檢測成牙本質(zhì)分化能力,經(jīng)成脂誘導(dǎo)后油紅0染色檢測成脂能力,PCR技術(shù)檢測人牙髓干細(xì)胞成牙本質(zhì)分化特異性標(biāo)志物DSPP和DMP-1。2.通過PCR技術(shù)和Western blot檢測GPNMB在人牙髓干細(xì)胞礦化誘導(dǎo)后成牙本質(zhì)分化中的表達(dá)。3.運(yùn)用RNA干擾技術(shù),對牙髓干細(xì)胞轉(zhuǎn)染敲除GPNMB基因的siRNA,應(yīng)用PCR技術(shù)和Western blot檢測GPNMB mRNA和蛋白的表達(dá)；及礦化誘導(dǎo)后牙髓干細(xì)胞的ALP活性和GPNMB礦化相關(guān)基因(DSPP和DMP-1)表達(dá)。結(jié)果：1.從成人阻生的健康第三磨牙牙髓組織成功分離、培養(yǎng)和鑒定人牙髓干細(xì)胞。 (1)細(xì)胞形態(tài)：培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞體積較小,相互間排列緊密,表現(xiàn)為典型的多形性特點(diǎn),以長梭狀為主。(2)牙髓干細(xì)胞培養(yǎng)克隆形成計數(shù)為每1000個細(xì)胞有31～50clones,克隆形成率為3.1-5.0%。(3)ALP堿性磷酸酶染色：礦化誘導(dǎo)后7天、14天,與對照組相比ALP堿性磷酸酶染色陽性,堿性磷酸酶活性增強(qiáng)。(4)茜素紅染色：礦化誘導(dǎo)液誘導(dǎo)7天后鏡下可見牙髓干細(xì)胞中出現(xiàn)少量黃褐色結(jié)晶；至21天細(xì)胞呈復(fù)層生長,且見團(tuán)塊狀紅褐色鈣化結(jié)節(jié)；定量分析顯示,7、14至21天礦化結(jié)節(jié)形成量隨時間延長逐漸增多,而未誘導(dǎo)組未見明顯礦化結(jié)節(jié)形成。(5)經(jīng)成脂誘導(dǎo)后,油紅0染色可見脂肪小滴形成。(6)牙髓干細(xì)胞誘導(dǎo)至1 4天成牙本質(zhì)分化特異性標(biāo)志物(DSPP、DMP-1)的表達(dá),隨時間升高。2.牙髓干細(xì)胞礦化誘導(dǎo)第0、7、1 4天GPNMB mRNA的表達(dá)與GPNMB蛋白的表達(dá)明顯升高(p0.05)。3.培養(yǎng)的牙髓干細(xì)胞轉(zhuǎn)染敲除GPNMB基因的siRNA后,GPNMB mRNA和蛋白的表達(dá)明顯降低、增殖能力增強(qiáng)；而礦化誘導(dǎo)后牙髓干細(xì)胞的ALP活性和GPNMB礦化相關(guān)基因(DSPP和DMP-1)表達(dá)與實驗組相比明顯降低(p0.05),表明人牙髓干細(xì)胞成牙本質(zhì)分化潛能下降。結(jié)論：1.從成人健康阻生的第三磨牙牙髓組織中可以分離出人牙髓干細(xì)胞,細(xì)胞的形態(tài)符合人牙髓干細(xì)胞形態(tài),并表現(xiàn)出良好的細(xì)胞克隆能力；經(jīng)培養(yǎng)鑒定表現(xiàn)出多向分化潛能,礦化誘導(dǎo)后表現(xiàn)出成牙本質(zhì)分化潛能。2.GPNMB參與了人牙髓干細(xì)胞體外誘導(dǎo)成牙本質(zhì)分化過程。3.GPNMB在調(diào)節(jié)人牙髓干細(xì)胞多向分化潛能中發(fā)揮重要作用,GPNMB的欠表達(dá)可以促進(jìn)人牙髓干細(xì)胞的增殖、抑制人牙髓干細(xì)胞體外向成牙本質(zhì)細(xì)胞的分化,因而GPNMB是成人牙髓干細(xì)胞體外成牙本質(zhì)分化中重要的細(xì)胞因子。
【關(guān)鍵詞】：牙髓干細(xì)胞 成牙本質(zhì)分化 細(xì)胞因子 GPNMB 細(xì)胞增殖
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R780.2
【目錄】：

• 中文摘要8-11
• Abstract11-14
• 縮略語表14-16
• 研究背景16-19
• 第一章 GPNMB在體外人牙髓干細(xì)胞成牙本質(zhì)分化中的表達(dá)19-49
• 1.1 材料19-21
• 1.1.1 儀器設(shè)備19
• 1.1.2 試劑與材料19-21
• 1.2 方法21-29
• 1.2.1 細(xì)胞來源21
• 1.2.2 人牙髓干細(xì)胞的分離與原代培養(yǎng)21
• 1.2.3 人牙髓干細(xì)胞的擴(kuò)增及純化21-22
• 1.2.4 細(xì)胞克隆形成實驗22-23
• 1.2.5 堿性磷酸酶活性鑒定成牙本質(zhì)細(xì)胞/成骨能力23
• 1.2.6 茜素紅染色與定量分析鑒定成牙本質(zhì)細(xì)胞/成骨能力23-24
• 1.2.7 油紅0染色鑒定人牙髓干細(xì)胞成脂能力24
• 1.2.8 人牙髓干細(xì)胞特異分子標(biāo)記物檢測24-26
• 1.2.9 GPNMR在人牙髓干細(xì)胞成牙本質(zhì)分化過程中的表達(dá)26-29
• 1.2.10 統(tǒng)計分析29
• 1.3 結(jié)果29-32
• 1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)形態(tài)29-30
• 1.3.2 細(xì)胞克隆形成實驗30
• 1.3.3 堿性磷酸酶(ALP)測定30
• 1.3.4 茜素紅染色與定量分析30
• 1.3.5 成脂能力鑒定30
• 1.3.6 人牙髓干細(xì)胞特異分子標(biāo)記物表達(dá)30
• 1.3.7 GPNMB在人牙髓干細(xì)胞成牙本質(zhì)分化過程中的表達(dá)30-32
• 1.4 討論32-37
• 1.5 結(jié)論37-39
• 附圖39-49
• 第二章 siRNA-GPNMB對DPSCs成牙本質(zhì)細(xì)胞分化的的作用49-65
• 1.1 材料49-51
• 1.1.1 儀器設(shè)備49
• 1.1.2 試劑與材料49-51
• 1.2 方法51-54
• 1.2.1 siRNA對人牙髓干細(xì)胞GPNMB表達(dá)的影響51-52
• 1.2.2 siRNA對人牙髓干細(xì)胞細(xì)胞增殖能力的影響52
• 1.2.3 siRNA對人牙髓干細(xì)胞細(xì)胞ALP活性的影響52-53
• 1.2.4 siRNA對人牙髓干細(xì)胞成牙本質(zhì)分化相關(guān)基因表達(dá)的影響53
• 1.2.5 統(tǒng)計分析53-54
• 1.3 結(jié)果54-55
• 1.3.1 siRNA對人牙髓干細(xì)胞GPNMB表達(dá)的影響54
• 1.3.2 siRNA對人牙髓干細(xì)胞細(xì)胞增殖能力的影響54
• 1.3.3 siRNA對人牙髓干細(xì)胞細(xì)胞ALP活性的影響54
• 1.3.4 siRNA對人牙髓干細(xì)胞成牙本質(zhì)分化相關(guān)基因表達(dá)的影響54-55
• 1.4 討論55-58
• 1.5 結(jié)論58-60
• 附圖60-65
• 參考文獻(xiàn)65-71
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄71-72
• 外文論文72-95
• 致謝95-97
• 學(xué)位論文評閱及答辯情況表97

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