本文關(guān)鍵詞：ERK通路調(diào)控正常及炎癥微環(huán)境內(nèi)牙周膜干細胞內(nèi)皮向分化的機制研究

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【摘要】：牙周炎作為常見的口腔慢性炎癥性疾病,常導致牙周支持組織破壞,進而造成牙齒脫落,并可以影響一些全身性疾病的發(fā)病和病程。但是至今對于牙周炎發(fā)病及病程發(fā)展的機制尚不完全明確。牙周炎在發(fā)病過程中,炎性組織可以產(chǎn)生血管生成因子和炎性細胞因子,促進細胞內(nèi)皮向分化,最終形成大量新生血管�，F(xiàn)已證實牙周膜干細胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)具有向內(nèi)皮細胞分化并形成血管的能力,但是對于調(diào)控其分化的胞內(nèi)機制尚不完全明確。細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)通路是調(diào)節(jié)細胞活動的關(guān)鍵通路之一,在真核細胞內(nèi)廣泛存在,影響著細胞分裂增殖、分化、自噬、凋亡等多種生理病理行為。ERK1/2是ERK通路的關(guān)鍵蛋白,ERK1/2的磷酸化和去磷酸化是將分子信號從細胞表面受體轉(zhuǎn)導至核內(nèi)的關(guān)鍵步驟。當細胞受到細胞外基質(zhì)的生長因子刺激后,ERK1/2通過一系列酶反應(yīng)被激活,從而對細胞的活動進行調(diào)節(jié)。牙周膜干細胞在不同局部微環(huán)境下的多向分化能力是否發(fā)生變化、如何變化、受到什么因素或信號的調(diào)節(jié)、對生物學功能有何影響等已經(jīng)有一些研究報道,但主要集中于成骨分化方向;對其他方向分化可能及影響程度等尚少有研究。本課題針對于此,使用TNF-α模擬炎癥微環(huán)境,觀察ERK通路的活化對正常及炎癥微環(huán)境下PDLSCs內(nèi)皮向分化的調(diào)控作用;為進一步深入探討不同分化方向能力變化和選擇性調(diào)控奠定實驗基礎(chǔ)。1研究目的:探討正常及炎癥微環(huán)境下,erk通路在pdlscs內(nèi)皮向分化中的作用,為pdlscs分化調(diào)控應(yīng)用提供理論依據(jù)。1.1體外培養(yǎng)和鑒定人牙周膜干細胞(hpdlscs)。使用血管內(nèi)皮生長因子(vascularendothelialgrowthfactor,vegf)和堿性成纖維細胞生長因子(basicfibroblastgrowthfactor,b-fgf)聯(lián)合誘導pdlscs內(nèi)皮向分化,檢測誘導后細胞內(nèi)皮向分化相關(guān)的相關(guān)指標水平,建立pdlscs內(nèi)皮向分化模型。在體外使用炎性因子tnf-α模擬體內(nèi)炎癥微環(huán)境對pdlscs進行刺激,并檢測內(nèi)皮向分化相關(guān)指標,建立炎癥微環(huán)境內(nèi)皮向分化模型。1.2按所建立正常及炎癥微環(huán)境內(nèi)皮向分化模型,對pdlscs進行內(nèi)皮向分化誘導,檢測誘導后細胞增殖情況和內(nèi)皮向分化相關(guān)指標水平。比較兩種不同誘導環(huán)境對pdlscs增殖和內(nèi)皮向分化的影響。1.3按照模型誘導pdlscs分化,觀察細胞內(nèi)erk1/2磷酸化水平隨不同時間點和誘導方法而發(fā)生的改變。1.4阻斷erk1/2磷酸化過程后,在正常及炎癥微環(huán)境對pdlscs進行內(nèi)皮向分化誘導,檢測誘導后細胞增殖情況和分化相關(guān)指標水平。比較阻斷前后細胞分化能力的改變,明確erk通路對pdlscs內(nèi)皮向分化的作用。2研究方法:2.1采用酶消化法獲取原代牙周膜細胞,單細胞克隆純化細胞。克隆形成實驗檢測細胞增殖能力,流式細胞術(shù)檢測細胞表面表達間充質(zhì)干細胞標志物的陽性率,成骨及成脂誘導定性檢測細胞多向分化能力。2.2對兩種誘導環(huán)境下的pdlscs進行內(nèi)皮向分化誘導,real-timepcr檢測pdlscs誘導后內(nèi)皮相關(guān)基因cd31、vegf及ve-cadherinmrna的轉(zhuǎn)錄水平。流式細胞術(shù)檢測誘導后細胞中cd31+和ve-cadherin+細胞比例。matrigeltm基質(zhì)膠內(nèi)進行細胞管腔形成實驗,并拍照統(tǒng)計管腔形成數(shù)目、分支節(jié)點數(shù)及管腔長度。根據(jù)這些指標比較正常及炎癥微環(huán)境pdlscs內(nèi)皮向分化能力的差異。2.3使用u0126作為erk1/2磷酸化阻斷劑,溶劑dmso作為陰性對照。提取pdlscs誘導后0h、1h、3h、6h、12h的蛋白,westernblotting檢測erk1/2磷酸化水平。正常及炎癥微環(huán)境內(nèi)誘導以及加入u0126后分化誘導1h,提取蛋白檢測erk1/2磷酸化水平。2.4加入u0126阻斷erk1/2磷酸化過程,正常及炎癥微環(huán)境內(nèi)對pdlscs進行內(nèi)皮向分化誘導,dmso作為陰性對照,real-timepcr檢測誘導后pdlscs內(nèi)皮相關(guān)基因cd31、vegf及ve-cadherinmrna轉(zhuǎn)錄水平;流式細胞術(shù)檢測誘導后細胞中cd31+和ve-cadherin+細胞比例;matrigeltm基質(zhì)膠內(nèi)進行細胞管腔形成實驗,并拍照統(tǒng)計管腔形成數(shù)目、分支節(jié)點數(shù)及管腔長度并進行比較。比較阻斷erk1/2磷酸化過程對pdlscs在兩種條件下內(nèi)皮向分化能力的差異。3研究結(jié)果:3.1原代培養(yǎng)純化后細胞呈長梭形,呈放射狀排列,長軸之間近于平行。鑒定細胞發(fā)現(xiàn)細胞具有克隆形成能力;流式細胞術(shù)結(jié)果顯示純化所得細胞高表達間充質(zhì)干細胞標志物,低表達造血干細胞標志物;成骨及成脂誘導實驗顯示細胞具有成骨和成脂分化潛能。3.2pdlscs內(nèi)皮向分化誘導后檢測內(nèi)皮向分化指標,real-timepcr和流式細胞術(shù)結(jié)果顯示,對于炎癥微環(huán)境中誘導分化的pdlscs,ve-cadherin和vegfmrna轉(zhuǎn)錄水平、cd31+和ve-cadherin+細胞比例顯著高于正常環(huán)境培養(yǎng)條件下,管腔形成能力也明顯高于正常環(huán)境培養(yǎng)條件下內(nèi)皮向分化誘導的pdlscs。3.3westernblotting顯示pdlscs經(jīng)過內(nèi)皮向分化誘導,erk1/2磷酸化水平升高,其中1h和3h顯著高于誘導前。選取誘導后1h這一時間點,分別在正常及炎癥微環(huán)境誘導和加入u0126后進行內(nèi)皮向分化誘導,發(fā)現(xiàn)炎癥微環(huán)境中誘導的p-erk1/2水平高于正常條件下,而u0126可以阻斷誘導引起的erk1/2的磷酸化過程。3.4real-timepcr和流式細胞術(shù)結(jié)果顯示,加入u0126后,pdlscs的內(nèi)皮細胞相關(guān)mrna轉(zhuǎn)錄水平、蛋白表達水平以及管腔形成能力均明顯降低,表明阻斷了erk1/2磷酸化過程會抑制pdlscs的內(nèi)皮向分化過程。但炎癥微環(huán)境中阻斷erk1/2磷酸化對內(nèi)皮向分化過程的抑制并不完全。結(jié)論:pdlscs被vegf和fgf誘導可以向內(nèi)皮細胞分化,這一過程受erk通路調(diào)控,阻斷erk通路可以抑制pdlscs的內(nèi)皮向分化。炎癥微環(huán)境下進行分化誘導會促進pldsc內(nèi)皮向分化過程,阻斷erk通路可以部分抑制pdlscs炎癥微環(huán)境下內(nèi)皮向分化過程。
【關(guān)鍵詞】：牙周膜干細胞 細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶 內(nèi)皮向分化 腫瘤壞死因子-α 炎性細胞因子
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R781.4
【目錄】：

• 縮略語表6-8
• 中文摘要8-12
• 英文摘要12-17
• 前言17-18
• 文獻回顧18-30
• 實驗一 內(nèi)皮向分化誘導對牙周膜干細胞增殖的作用30-37
• 1 材料30-32
• 1.1 主要試劑30-31
• 1.2 主要器械和儀器31-32
• 2 方法32-33
• 2.1 臨床取材及細胞培養(yǎng)32
• 2.2 細胞純化32
• 2.3 細胞表面干細胞相關(guān)蛋白表達32-33
• 2.4 多向分化誘導能力鑒定33
• 2.5 克隆形成率檢測33
• 2.6 統(tǒng)計方法33
• 3 結(jié)果33-36
• 3.1 牙周膜細胞培養(yǎng)與純化33
• 3.2 PDLSCs細胞表面蛋白表達33-34
• 3.3 PDLSCs多向分化誘導34-35
• 3.4 克隆形成率35-36
• 4 討論36-37
• 實驗二TNF-α上調(diào)PDLSCs的內(nèi)皮向分化能力37-49
• 1 材料37-38
• 1.1 主要實驗試劑37-38
• 1.2 主要儀器38
• 2 方法38-41
• 2.1 正常及炎癥微環(huán)境PDLSCs內(nèi)皮向分化誘導38-39
• 2.2 CCK8檢測細胞增殖39
• 2.3 實時定量PCR檢測內(nèi)皮向分化相關(guān)基因表達39-41
• 2.4 流式細胞儀檢測內(nèi)皮向分化蛋白表達41
• 2.5 MatrigelTM基質(zhì)膠管腔形成實驗41
• 2.6 統(tǒng)計方法41
• 3 實驗結(jié)果41-45
• 3.1 TNF-α對PDLSCs誘導過程增殖的影響41-42
• 3.2 各組CD31、VEGF、VE-cadherin m RNA表達水平比較42-43
• 3.3 各組CD31、VE cadherin蛋白表達水平比較43-44
• 3.4 各組在MatrigelTM基質(zhì)膠內(nèi)的管腔形成率44-45
• 4 討論45-49
• 實驗三ERK通路調(diào)控PDLSCs的內(nèi)皮向分化過程49-63
• 1 材料49-50
• 1.1 主要實驗試劑49-50
• 1.2 主要儀器50
• 2 方法50-52
• 2.1 細胞誘導并檢測分化能力50-51
• 2.2 提取細胞蛋白及蛋白定量51
• 2.3 蛋白質(zhì)印跡法檢測ERK1/2 磷酸化水平51-52
• 2.4 各組內(nèi)皮向分化相關(guān)指標檢測52
• 2.5 統(tǒng)計方法52
• 3 結(jié)果52-61
• 3.1 阻斷ERK1/2 磷酸化過程對PDLSCs誘導過程增殖的影響52-53
• 3.2 內(nèi)皮向分化誘導上調(diào)了ERK1/2 的磷酸化水平53-54
• 3.3 TNF-α上調(diào)內(nèi)皮向分化過程ERK1/2 的磷酸化水平54-55
• 3.4 阻斷ERK1/2 磷酸化過程抑制PDLSCs誘導后CD31、VEGF、VE-cadherinmRNA表達55-56
• 3.5 阻斷ERK1/2 磷酸化過程抑制PDLSCs誘導后CD31、VEGF、VE-cadherin的蛋白表達56-59
• 3.6 阻斷ERK1/2 磷酸化過程抑制PDLSCs誘導后在Matrigel~(TM)基質(zhì)膠內(nèi)的管腔形成能力59-61
• 4 討論61-63
• 小結(jié)63-64
• 參考文獻64-69
• 個人簡歷和研究成果69-70
• 致謝70-71

，

本文編號：1064130