本文關鍵詞：IGF-1對人牙髓細胞增殖分化影響的體外及裸鼠體內(nèi)研究

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【摘要】：目的:探究在胰島素樣生長因子-1(insulin-like growth factor-1,IGF-1)的作用下,人牙髓細胞體外及裸鼠體內(nèi)的增殖、分化情況。方法:本實驗選取因阻生或者正畸減數(shù)拔除的健康恒牙(經(jīng)患者知情同意),采用組織塊酶消化法分離、提取人牙髓細胞并進行原代培養(yǎng),當細胞增殖達到培養(yǎng)瓶底的80%時,用0.25%胰蛋白酶消化并且傳代,選取第四代人牙髓細胞作為種子細胞進行以下實驗:1 IGF-1對人牙髓細胞體外增殖的影響以2×10~4個/孔人牙髓細胞接種于96孔培養(yǎng)板中,按照5行×5列,共25個孔的規(guī)格進行接種,共接種4個板。細胞培養(yǎng)24小時后,吸凈培養(yǎng)液,每一列為一組,實驗組分別用含2%血清濃度的50ng/ml、75ng/ml、100ng/mlIGF-1培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng),對照組用含2%血清濃度的培養(yǎng)液培養(yǎng),每三天更換一次培養(yǎng)液,分別于第1天、第3天、第5天、第7天采用MTT法檢測細胞的體外增殖情況。MTT法檢測具體如下:每孔加20μl甲基噻唑基四唑(Methyl Thiazolyl Tetrazolium,MTT),4小時后吸凈培養(yǎng)液,每孔加150μl二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)溶液,酶標儀以450nm波長檢測各孔吸光度(OD)值。2人牙髓細胞在裸鼠體內(nèi)的增殖分化情況1)人牙髓細胞接種于脫細胞真皮基質(zhì)(acellular dermal matrix,ADM)支架:將ADM支架置于滅菌好的生物安全柜中,裁剪成1cm×1cm×1cm大小,放入48孔板中,加入100μl胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)預濕,并放置于CO2恒溫箱中24小時,24小時后吸凈培養(yǎng)液備用。選取第四代人牙髓細胞,制備成2×10~5個/ml人牙髓細胞懸液,采取點種接種的方式將人牙髓細胞接種到ADM支架上,靜置半小時,使人牙髓細胞充分進入到ADM支架的孔隙中,再加入含100ng/mlIGF-1的礦化液(含10%FBS的DMEM,10mmol/Lβ-甘油磷酸鈉,100mg/ml維生素C,10 nmol/L地塞米松)1ml,培養(yǎng)3天;2)ADM支架移植到裸鼠體內(nèi):選取4周齡的免疫缺陷鼠,在無菌條件下切開其左背部皮膚,血管鉗鈍性分離,傷口長約1cm,將用含100ng/mlIGF-1的礦化液培養(yǎng)過3天的adm支架-人牙髓細胞復合體移植到裸鼠左背部皮下,并拉攏縫合,該側為實驗側;同樣方法切開右側背部皮膚,鈍性分離,將空白支架移植到裸鼠右背部皮下,并拉攏縫合,該側為對照側。飼養(yǎng)2周后麻藥過量處死一半裸鼠,飼養(yǎng)4周后麻藥過量處死另一半。處死后立即將裸鼠體內(nèi)支架復合物取出,部分進行冰凍,然后切片,進行he染色,茜素紅染色,masson三色法染色,于光學顯微鏡下觀察。部分支架復合物立即放入4%戊二醛溶液中固定,制備超薄切片,透射電鏡觀察;3)用spss21.0統(tǒng)計軟件,數(shù)據(jù)結果以均數(shù)±標準差表示,采用單因素方差分析及s-n-k法進行統(tǒng)計學分析,p0.05為有統(tǒng)計學意義。結果:1通過組織塊酶解法,在體外成功分離并培養(yǎng)出了人牙髓細胞,免疫組化法結果提示波形絲蛋白染色陽性,角蛋白染色陰性,證實人牙髓細胞來源于中胚層間充質(zhì)細胞。2通過mtt法檢測IGF-1不同濃度(50~100ng/ml)對人牙髓細胞增殖的影響,結果為人牙髓細胞培養(yǎng)至第5天和7天時,IGF-1組增殖均高于對照組(p0.05),并隨著濃度的升高,細胞增殖越明顯,100ng/mlIGF-1組細胞增殖最顯著(p0.01)。3將adm支架-牙髓細胞復合物移植到裸鼠體內(nèi)后,分別培養(yǎng)2周、4周后,取出支架-細胞復合物部分進行冰凍切片:he染色,可見大量的成纖維細胞;茜素紅染色能夠看見明顯的礦化結節(jié);masson三色法染色提示藍染的膠原纖維。4將在裸鼠體內(nèi)培養(yǎng)了2周、4周后的adm支架-細胞復合物取出,制備成超薄切片,采用透射電鏡觀察,結果顯示:細胞內(nèi)大量線粒體,高爾基體復合物,同時能夠看到膠原纖維。結論:1通過組織塊酶消化法成功培養(yǎng)出了人牙髓細胞,經(jīng)過免疫組化法鑒定細胞來源于中胚層間充質(zhì)干細胞,選取增殖能力強,細胞形態(tài)好的第四代人牙髓細胞作為種子細胞,符合實驗要求。2人牙髓細胞對IGF-1具有濃度依賴性,在50ng/ml~100ng/ml濃度范圍促增殖作用明顯,且IGF-1為100ng/ml濃度時,細胞增殖最明顯。3 ADM支架-人牙髓細胞復合物經(jīng)裸鼠體內(nèi)培養(yǎng)后,制備冰凍切片及超薄切片,經(jīng)光學顯微鏡觀察及透射電鏡,證實IGF-1可以在體外及裸鼠體內(nèi)促進人牙髓細胞的增殖分化。
【關鍵詞】：人牙髓細胞 IGF-1 ADM支架 增殖 分化 裸鼠
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R78
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-10
• 英文縮寫10-11
• 前言11-12
• 材料與方法12-20
• 結果20-22
• 附圖22-29
• 附表29-30
• 討論30-35
• 結論35-36
• 參考文獻36-39
• 綜述 支架在牙髓再生中的應用39-49
• 參考文獻44-49
• 致謝49-50
• 個人簡歷50

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前4條

1 王靈平;張春蓮;胡順鵬;李文波;曹成波;;脫細胞真皮基質(zhì)的制備與性能分析[J];山東大學學報(醫(yī)學版);2011年09期

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3 王身國;組織工程細胞支架[J];中國康復理論與實踐;2002年05期

4 王身國,侯建偉,貝建中;組織工程及周圍神經(jīng)修復[J];高技術通訊;1999年02期

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本文編號：1060712