本文關鍵詞：急性多重應激致認知損傷的機制及防治研究

  更多相關文章： 急性多重應激 樹突結構 LW-AFC PCR芯片 蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡

【摘要】：應激(stress)是在內(nèi)外環(huán)境變化的刺激下,機體出現(xiàn)的非特異性全身反應,包括精神、神經(jīng)、內(nèi)分泌和免疫等方面。在眾多應激的人群中,軍人是一個特殊的群體。軍人的職業(yè)特點就意味著要經(jīng)常面對高強度的應激。戰(zhàn)場應激反應,是軍人在戰(zhàn)爭時期極易發(fā)生的一種應激反應,包括急性應激和慢性應激。急性戰(zhàn)場應激反應多在軍人進入突發(fā)、意外、恐怖、緊張、危險、殘酷的環(huán)境中即刻或幾分鐘內(nèi)出現(xiàn)。其主要表現(xiàn)為生理性的過度激起,可能發(fā)生威脅生命的行為,該行為持續(xù)數(shù)分鐘到數(shù)小時。發(fā)生急性戰(zhàn)場應激反應時易出現(xiàn)記憶力下降、注意力不集中、反應能力下降、視覺敏感力和言語交談能力下降、無目的的動作、判斷能力下降、很難執(zhí)行甚至是簡單的任務、軍事作業(yè)能力下降,后期甚至出現(xiàn)創(chuàng)傷后應激障礙(post-traumatic stress disorder, PTSD)等現(xiàn)象。慢性戰(zhàn)場應激反應是軍人長期處于戰(zhàn)爭環(huán)境中所產(chǎn)生的一種應激反應,表現(xiàn)為低活度的狀態(tài)、脫離群體、抑郁、違反紀律、酗酒和物質(zhì)濫用等現(xiàn)象。因此戰(zhàn)場應激使部隊戰(zhàn)斗力受到嚴重影響,也是造成非戰(zhàn)斗性減員的主要原因之一。對軍人來說,急性應激反應所持續(xù)的時間正是其執(zhí)行作戰(zhàn)、救援、維穩(wěn)、閱兵等任務的關鍵期。而在現(xiàn)代高科技下,認知能力所占的權重越來越大。故如果能預防急性戰(zhàn)場應激所造成的認知損傷,將能極大地提高部隊的戰(zhàn)斗力。而目前對于應激敏感人員的篩查尚缺乏特異性的生物學指標,主要為臨床評定量表。但是該方法存在主觀性強、重復率低、準確性和特異性均不高等問題。另一方面,對于戰(zhàn)場急性應激,主要的干預措施為心理咨詢、心理治療,且為事后干預,尚缺乏防治藥物。本研究從急性戰(zhàn)場應激所造成的認知損傷入手,一方面尋找篩查抗應激人員的生物標志物,另一方面發(fā)現(xiàn)預防急性應激致認知損傷的藥物。為了達到以上兩方面的目的,本研究首先模擬戰(zhàn)場中突發(fā)的急性復雜的應激因素,建立了急性多重應激致認知損傷的動物模型,并對模型的學習記憶能力和血漿皮質(zhì)酮濃度進行了檢測；其次,采用高爾基染色技術對所建立的急性多重應激致認知損傷模型的神經(jīng)元數(shù)目、樹突以及突觸結構的變化進行了檢測;進而,采用PCR芯片技術檢測了急性多重應激致認知損傷模型的海馬、皮層和血液中可能與應激和認知有關分子的mRNA表達變化,接著將不同部位差異表達分子及其樹突結構的變化進行了相關性分析,并對其功能進行了生物信息學解析,發(fā)現(xiàn)了急性多重應激致認知損傷的標志性分子；最后,考察了組分中藥LW-AFC對急性多重應激致認知損傷的預防作用,發(fā)現(xiàn)LW-AFC具有改善被動回避反應能力和調(diào)節(jié)皮層相關分子表達變化的作用。具體研究結果如下：一、急性多重應激致認知損傷的機制研究1.急性多重應激致認知損傷動物模型的建立模擬戰(zhàn)場中突發(fā)的急性復雜的應激因素,如槍、炮、地雷等武器形成的震波和行軍顛簸、高分貝的噪聲、爆炸引起的強光、饑餓、缺水、裝備束縛、人員擁擠、看到戰(zhàn)友傷亡的場面、發(fā)生于數(shù)小時內(nèi)。本研究對應給予BALB/c小鼠5hr的搖床振蕩、噪音、強光刺激、禁食、禁水、束縛、振蕩時相互碰撞、看到同伴不舒服狀態(tài)的刺激。其中,根據(jù)光強、振蕩速度及噪音強度參數(shù)的不同將應激分為輕、中和重度三個應激程度,檢測三種條件下模型動物學習記憶能力及應激激素水平的變化。結果如下：1.1急性多重應激致認知損傷動物模型的學習記憶能力1.1.1被動回避反應能力給予BALB/c小鼠三種程度的應激后,采用跳臺實驗方法檢測動物被動回避反應能力。結果發(fā)現(xiàn),應激后成功小鼠的百分率和潛伏期出現(xiàn)程度依賴性地下降,其中重度應激組的潛伏期與對照組相比下降明顯(P0.05)。而應激后的錯誤次數(shù)出現(xiàn)程度依賴性地升高,其中重度應激組的錯誤次數(shù)與對照組相比差異明顯(P0.05)。這些結果顯示,急性多重應激可以程度依賴性地導致小鼠被動回避反應能力損傷。1.1.2物體識別記憶能力采用新異物體識別實驗方法檢測動物的物體識別記憶能力。結果發(fā)現(xiàn),對照組及輕度應激組動物探索新物體的時間明顯長于探索舊物體的時間,即對新、舊兩物體探索時間有明顯差別,說明動物仍具有對新異物體感興趣的特性,即對舊物體有記憶能力；而中度應激組和重度應激組的動物對新、舊兩物體的探索時間無明顯差別,說明應激明顯損害了動物對舊物體的記憶能力。結果提示急性多重應激程度依賴性地損傷了受試動物的物體識別記憶能力。1.2急性多重應激致認知損傷動物模型的血漿皮質(zhì)酮含量為檢測不同程度急性多重應激條件下受試小鼠血漿皮質(zhì)酮水平的變化,在應激開始后30、60、90和120min以及應激結束后4、8和16min,我們對受試動物采血,取血漿,并用ELISA的方法檢測了它們血漿皮質(zhì)酮的含量。結果顯示,無論是在應激開始過程中還是結束后均檢測到三個應激組的血漿皮質(zhì)酮濃度明顯高于對照組,但三者之間無明顯區(qū)別。結果提示,應激可引起血漿皮質(zhì)酮濃度升高,但其濃度變化幅度與應激程度的大小無明顯關系。2.急性多重應激對樹突和突觸結構的影響為觀察急性多重應激對受試動物學習記憶相關腦區(qū)樹突和突觸結構的影響,本研究在給予受試小鼠輕、中和重度應激后30min,取一半腦用于高爾基染色觀察腦組織樹突結構和透射電子顯微鏡觀察腦組織突觸超微結構(另一半腦用于分子檢測),并對整個半腦腦區(qū)及海馬和皮層高爾基染色顯示的樹突長度、分支數(shù)目和樹突棘密度進行定量分析。結果顯示,急性多重應激對整個半腦腦區(qū)、海馬和皮層的神經(jīng)元數(shù)目均無明顯影響,但卻顯著地損傷了海馬和皮層的樹突和突觸結構。大腦皮層以及其各功能分區(qū)包括視皮層、聽覺皮層和嗅皮層的樹突長度、分支數(shù)目和樹突棘密度測量結果顯示：與對照組相比,重度應激組的整個大腦皮層的樹突棘密度明顯降低,中度和重度應激組視皮層樹突長度明顯縮短,而輕度應激組聽覺皮層樹突分支數(shù)目明顯增加。不同應激程度組比較的結果顯示,重度應激組聽覺皮層樹突棘密度減少程度顯著高于輕度和中度應激組。海馬以及其各分區(qū)包括齒狀回、CA1、CA2和CA3的樹突長度、分支數(shù)目和樹突棘密度測定的結果顯示,與對照組相比,三種程度的應激均降低了海馬和海馬CA1區(qū)的樹突棘密度；輕度應激降低了海馬CA1的樹突長度；重度應激使海馬CA3區(qū)的樹突分支數(shù)目減少。采用透射電子顯微鏡觀察了不同程度的急性多重應激對大腦皮層及海馬突觸結構的影響,結果發(fā)現(xiàn),急性多重應激降低了突觸囊泡的數(shù)目、增加了突觸間隙、降低了突觸的曲率并減少了突觸后膜致密質(zhì)的厚度。其中重度應激組與對照組相比對突觸囊泡的數(shù)目以及突觸的曲率降低最明顯,這些結果顯示,急性多重應激程度依賴性地損傷了海馬的突觸結構。3.急性多重應激對中樞和外周mRNA表達的影響為探索急性多重應激對受試小鼠海馬、皮層和外周血中與應激和認知有關的基因表達情況,采用PCR芯片的方法檢測了有文獻報道的90個可能與應激和認知功能有關分子mRNA的表達情況,結果發(fā)現(xiàn)：3.1海馬mRNA的表達在海馬中,輕度應激引起ACHE、NEFH和BACE1等12個分子的mRNA表達上調(diào),而KCNA4、GRIA2、GRIA3、PSEN2和ROCKl的mRNA表達下調(diào)：中度應激引起ACHE、 APBB1和UBQLN1等20個分子的mRNA表達上調(diào),而KCNA4、GRIA3和PSEN1的mRNA表達下調(diào)；重度應激引起SNCA、NTRK3、KCNA4和NOTCH3的mRNA表達下調(diào),這些基因的表達變化隨著應激程度的增加出現(xiàn)7種不同的變化形式。而KCNA4、 NOTCH3、NTRK3和SNCA的mRNA表達呈現(xiàn)應激程度依賴性的表達下降。3.2皮層mRNA的表達在皮層中,輕度應激引起APBB1、CLSTN1和KCNA4等50個分子的mRNA表達下調(diào),而KCNA1的mRNA表達上調(diào)；中度應激引起GSN、ITM2C和APBB1等26個分子的mRNA表達下調(diào),而KCNA1的mRNA表達上調(diào)；重度應激引起APBB1、CLSTNl和KCNA4等8個分子的mRNA表達下調(diào),而KCNA1的mRNA表達上調(diào),這些基因的表達變化隨著應激程度的增加出現(xiàn)了5種不同的變化形式。3.3外周血mRNA的表達在外周血中,輕度應激引起B(yǎng)ACE1、CRYAB和FGF2等7個分子的mRNA表達下調(diào),而FOS的mRNA表達上調(diào)；中度應激引起B(yǎng)ACE1、CRYAB和FGF2等5個分子的mRNA表達下調(diào),而AGER、APP和PSEN1等5個分子的mRNA表達上調(diào)；重度應激引起B(yǎng)ACE1、CRYAB和FGF2等5個分子的mRNA表達下調(diào),而FOS的mRNA表達上調(diào),這些基因的表達變化隨著應激程度的增加出現(xiàn)了5種不同的變化形式。應激組BACE1的表達明顯下調(diào),FOS的表達明顯上調(diào),二者均與應激程度密切相關。隨著應激程度的增加,BACE1下調(diào)程度逐漸增加,而FOS上調(diào)程度逐漸增加。該結果提示,BACE1和FOS表達變化的程度與應激程度密切相關,而有可能與認知損傷程度相關,有作為應激程度指示劑或認知損傷標志物進行深入研究的必要。3.4差異表達分子與樹突結構的相關性分析為探索差異表達分子與樹突結構變化之間的相關性,本研究用Pearson相關性分析的方法來考察海馬和皮層中樹突結構的改變與差異表達分子之間的相關性。結果發(fā)現(xiàn),在皮層中,應激所引起的CLSTN1、PLAU和NOTCH3的表達變化與聽覺皮層樹突分支數(shù)目的變化呈負相關；而TGFB1的表達變化與視覺皮層中樹突棘數(shù)目的變化呈正相關。在海馬中,NOTCH3的表達變化與其CA3區(qū)樹突的分支數(shù)目變化呈正相關。這些結果提示,CLSTN1、PLAU, NOTCH3和TGFB1可能是應激致認知損傷相關的重要分子。3.5各部位間差異表達分子的相關性分析為了探索中樞和外周血之間差異表達分子的關系,本研究用Pearson相關性分析的方法來分析皮層與外周血以及海馬與外周血差異表達分子之間的相關性。結果發(fā)現(xiàn),BACE1在皮層和外周血中的表達變化呈正相關,提示外周血中BACE1的變化可以反映其在腦中的變化,有作為認知損傷標志物進行深入研究的必要。4.急性多重應激致樹突結構損傷相關分子網(wǎng)絡為了找出應激致樹突結構損傷的分子網(wǎng)絡,本研究用與樹突結構變化具有相關性的四個差異表達變化分子CLSTN1、PLAU、NOTCH3和TGFB1作為種子構建PPI網(wǎng)絡。結果,我們得到了一個具有59個節(jié)點、136個邊,網(wǎng)絡直徑為6的PPI網(wǎng)絡。其中,TGFB1、 PLAU和NOTCH3度數(shù)(degree)分別為28、12和9,處于網(wǎng)絡的核心位置。綜合實驗和網(wǎng)絡分析的結果提示,TGFB1、PLAU和NOTCH3可能是急性多重應激致樹突結構損傷的關鍵分子。進而,我們采用DAVID平臺上的GO功能注釋和KEGG通路富集的方法分別對PPI網(wǎng)絡中的分子進行功能分析。GO功能注釋結果顯示,跨膜受體蛋白絲氨酸／蘇氨酸激酶信號傳導通路(transmembrane receptor protein serine/threonine kinase signaling pathway).轉化生長因子p受體信號轉導通路(TGF-beta receptor signaling pathway)、Notch信號傳導通路(notch signaling pathway)排列在前三位。KEGG通路富集的方法所得到的前三位通路分別為：Notch信號傳導通路(notch signaling pathway)、補體和凝血級聯(lián)(complement and coagulation cascades)、轉化生長因子p受體信號轉導通路(TGF-beta signaling pathway).兩個方法的結果提示Notch和轉化生長因子p受體信號轉導通路與急性多重應激致樹突結構損傷關系最為密切,進而提示急性多重應激引起樹突結構損傷且最終導致認知損傷的最可能的通路是Notch和TGF-beta信號通路。二.LW-AFC對急性多重應激致認知損傷的預防作用研究1.LW-AFC對急性多重應激模型被動回避反應能力損傷的作用本研究采用跳臺實驗檢測了急性多重應激后小鼠的被動回避反應能力。結果發(fā)現(xiàn),應激組的成功小鼠百分率明顯低于對照組,而陽性藥和LW-AFC給藥后對應激造成的成功小鼠百分率下降現(xiàn)象均有改善作用,其中LW-AFC中劑量和高劑量效果最好。應激組的潛伏期與對照組相比明顯下降,而給予陽性藥和LW-AFC后對應激造成的潛伏期下降現(xiàn)象均有改善作用,其中陽性藥和LW-AFC中劑量和高劑量效果較為明顯。另外,應激組的錯誤次數(shù)明顯高于對照組,而陽性藥、LW-AFC中劑量和高劑量對應激所造成的錯誤次數(shù)升高現(xiàn)象均有改善作用,其中LW-AFC中劑量和高劑量效果最好。結果提示LW-AFC預防給藥對急性多重應激造成的被動回避反應能力損傷具有明顯的改善作用。2. LW-AFC對急性多重應激模型mRNA表達變化的調(diào)節(jié)作用跳臺實驗結束后,小鼠斷頭取腦,并分離出皮層,進而用PCR芯片的方法檢測了皮層中90個與應激和認知功能相關的分子。結果發(fā)現(xiàn),應激使皮層中NEFHvNEFM、 NSF、PLAU、PRKCA、STAT3、STUB1、APBB1、NTRK3、GRIA2和NOTCH3的表達下調(diào)。而給予LW-AFC后,NEFH、PLAU、STAT3和STUB1有明顯的上調(diào)的趨勢。3. LW-AFC所調(diào)節(jié)的能夠改善急性多重應激模型認知損傷的分子網(wǎng)絡特征應激致認知損傷是通過擾動具有多個生理功能的網(wǎng)絡而引起的,LW-AFC是通過調(diào)節(jié)怎樣的分子網(wǎng)絡而改善急性多重應激致認知功能的損傷。本研究首先得到了在皮層中LW-AFC所調(diào)節(jié)的4個應激引起差異表達的分子,即NEFH、PLAU、STAT3和STUB1,以它們作為種子來構建PPI網(wǎng)絡,得到了一個具有9個節(jié)點、10個邊,網(wǎng)絡直徑為4的特異的PPI網(wǎng)絡。其中網(wǎng)絡中的9個分子為MAPK1、STAT3、AR、STUB1、NEFH、 PLAT、PLAU、MET和HGF。提示,LW-AFC可能通過調(diào)節(jié)由MAPK1、STAT3、AR、 STUB1、NEFH、PLAT、PLAU、MET和HGF多個分子組成的相互作用網(wǎng)絡,進而改善急性多重應激所引起的被動回避反應能力損傷。隨后結合DAVID平臺上的GO功能注釋和KEGG通路富集的方法分別對LW-AFC所調(diào)節(jié)的PPI網(wǎng)絡中的分子進行功能分析,GO功能注釋結果顯示酶聯(lián)受體蛋白信號通路(enzyme linked receptor protein signaling pathway)排在首位。而KEGG通路富集的方法發(fā)現(xiàn)癌癥途徑(Pathways in cancer)排在首位。結果提示,LW-AFC所調(diào)節(jié)的相互作用分子可能參與酶聯(lián)受體蛋白信號通路和癌癥途徑。通過以上研究,得到以下結論：1.不同程度的急性多重應激程度依賴性地引起受試小鼠被動回避反應能力、物體識別記憶能力的損傷以及海馬和皮層中樹突和突觸結構的損傷。其所涉及的關鍵分子為PLAU、NOTCH3和TGFB1,而關鍵的信號通路為Notch和TGF-beta信號通路。2.外周血中BACE1和FOS的表達可以反映應激程度的改變,有望成為應激致認知損傷的生物標志物。3. LW-AFC對急性多重應激所致的認知損傷具有保護作用。其發(fā)揮該作用的途徑可能是調(diào)節(jié)PLAU、NEFH、STAT3和STUB1等所組成的分子相互作用網(wǎng)絡以及其所涉及的酶聯(lián)受體蛋白信號通路和癌癥途徑。
【關鍵詞】：急性多重應激 樹突結構 LW-AFC PCR芯片 蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡
【學位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R749.1
【目錄】：

• 縮略詞表6-9
• 中文摘要9-15
• 英文摘要15-24
• 前言24-29
• 材料與方法29-44
• —、 實驗材料29-35
• 二、 實驗方法35-44
• 實驗結果44-90
• 第一部分 急性多重應激致認知損傷的機制研究44-84
• 1. 急性多重應激致認知損傷模型的制備44-48
• 1.1 急性多重應激致認知損傷模型的學習記憶能力44-47
• 1.1.1 自主活動性篩查44-45
• 1.1.2 應激后情緒恢復45
• 1.1.3 被動回避反應能力45-46
• 1.1.4 物體識別記憶能力46-47
• 1.2 急性多重應激致認知損傷模型血漿的皮質(zhì)酮含量47-48
• 2. 急性多重應激對樹突和突觸結構的影響48-59
• 2.1 神經(jīng)元數(shù)目49-50
• 2.2 樹突結構50-58
• 2.2.1 海馬樹突結構50-53
• 2.2.2 皮層樹突結構53-58
• 2.3 突觸結構58-59
• 3. 急性多重應激對中樞和外周mRNA表達的影響59-81
• 3.1 海馬mRNA的表達60-66
• 3.2 皮層mRNA的表達66-75
• 3.3 外周血mRNA的表達75-79
• 3.4 差異表達變化分子與樹突結構的相關性分析79-80
• 3.5 各部位間差異表達變化分子間的相關性分析80-81
• 4. 急性多重應激所致樹突結構損傷相關分子網(wǎng)絡81-84
• 第二部分 LW-AFC對急性多重應激致認知損傷的預防作用研究84-90
• 1. LW-AFC對急性多重應激模型體重的影響84-85
• 2. LW-AFC對急性多重應激模型被動回避反應能力損傷的作用85
• 3. LW-AFC對急性多重應激模型mRNA表達變化的調(diào)節(jié)作用85-88
• 4. LW-AFC調(diào)節(jié)的急性多重應激模型的分子網(wǎng)絡88-90
• 討論90-97
• 結論97-98
• 參考文獻98-111
• 代表性論著111-125
• 個人簡歷125-126
• 致謝126

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本文編號：983650