本文關(guān)鍵詞：FPS-ZM1對糖基化終產(chǎn)物所致大鼠海馬區(qū)炎性反應(yīng)和Aβ異常代謝的影響與機制研究

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【摘要】：研究背景 阿爾茲海默病(AD)是一種起病隱匿且慢性進行性發(fā)展的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病,以記憶力下降和認知功能障礙為主要臨床表現(xiàn)。如今AD已成為老年人癡呆最常見的病因,并隨著我國老齡化程度的加劇和日益增高的發(fā)病率,逐漸成為繼心血管病、腫瘤與腦卒中之后威脅老年人健康的第四大殺手[1],給社會和家庭帶來沉重的負擔,因此如何遏制AD的發(fā)生發(fā)展成為亟待解決的問題。己知AD主要病理改變是細胞外老年斑沉積,細胞內(nèi)神經(jīng)原纖維纏結(jié)及腦內(nèi)慢性炎癥[2]。p淀粉樣蛋白(Beta amyloid protein,Aβ)是由β分泌酶(βsecretion enzyme, BACE1)等水解淀粉樣前體蛋白(amyloid precusor protein,APP)而產(chǎn)生的一種非特異性結(jié)合蛋白。近年研究顯示,Ap不僅能聚集參與AD特征性病理改變即老年斑的形成,而且在早期能與晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(RAGE)結(jié)合[3],激活相應(yīng)的細胞內(nèi)信號通路,進而引發(fā)神經(jīng)元毒性、氧化應(yīng)激與炎性等級聯(lián)反應(yīng),成為各種原因誘發(fā)AD的共同通路,參與不同階段的神經(jīng)損傷,最終導(dǎo)致記憶等認知方面的下降[4,5]。因此Ap是AD形成和發(fā)展的關(guān)鍵因素,減少Ap的生成有希望成為阻斷AD進程的有效手段。 糖基化終產(chǎn)物((advaneed glycation end products,AGEs)是蛋白質(zhì)的氨基與還原糖的羰基在無酶不可逆條件下形成的不溶性聚合物,高糖狀態(tài)及老齡人體內(nèi)AGEs增加。近年來有大量研究證據(jù)表明,AGEs參與糖尿病中(腎、腦、足、視網(wǎng)膜及骨等)各種靶器官的損害[6,7]。研究亦表明2型糖尿病是AD發(fā)生的危險因素之一,AD可能與糖尿病一樣,是一種內(nèi)分泌紊亂導(dǎo)致的代謝性疾病[8]。Carvalh發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠皮層和海馬區(qū)Ap明顯增多,并且在AD動物模型中,早期老年斑周圍也均有AGES表達[9],說明AGEs,糖尿病及AD三者之間有著密切的聯(lián)系。不僅如此,研究者發(fā)現(xiàn)隨著AD動物模型病程的進展,AGES與Ap均聚集逐漸增多[1o],進一步提示AGES是導(dǎo)致AD病理改變的主要因素之一,且貫穿于AD病程始末。糖基化終產(chǎn)物受體(receptor for advanced glycation endproducts,RAGE)是AGEs和Ap的共同受體,廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的細胞膜上,在AD患者腦中高表達。RAGE能介導(dǎo)Ap通過血腦屏障(blood brain barrier,BBB)加劇Ap的聚集和神經(jīng)纖維的纏結(jié),并通過與其配體AGES或Aβ結(jié)合活化小膠質(zhì)細胞從而引發(fā)炎癥反應(yīng),導(dǎo)致炎癥因子正反饋上調(diào)RAGE的自身表達,形成惡性循環(huán),使神經(jīng)損傷進一步擴大[1l]。目前已有研究證實,RAGE與其配體AGES結(jié)合引起的一系列反應(yīng)是導(dǎo)致糖尿病腦損害和AD發(fā)生血管病變及認知障礙的共同通路,同時AGEs也在衰老中起重要作用。因此阻斷RAGE與AGES的結(jié)合,可能會在很大程度上遏制上述疾病尤其是AD的進展。上述研究提示RAGE可能是治療AD的有效靶點。當前阻斷RAGE的手段主要有RAGE抗體及sRAGE,且體內(nèi)體外實驗均取得一定效果,但由于二者皆不能通過BBB作用于腦內(nèi)的RAGE來干擾AGES的代謝,因此迄今為止仍無有效抑制RAGE的方法[12,13]。此外,目前的治療AD藥物臨床療效并不十分理想[1]。新近研發(fā)的RAGE阻斷劑(PF-04494700)在臨床前期實驗的確能改善AD癥狀,但由于毒副作用太大而停用[14]。因此,研發(fā)既能通過血腦屏障又安全高效的RAGE阻斷藥物,具有更重要的意義。FPS-ZM1是由Deane等首次人工合成的無毒性RAGE特異性阻斷劑。通過用FPS-ZM1干預(yù)APP轉(zhuǎn)基因小鼠發(fā)現(xiàn),該藥能通過血腦屏障作用于腦內(nèi)RAGE,從而阻斷RAGE與Ap的結(jié)合引發(fā)的炎性反應(yīng),并能阻斷外周Ap與血腦屏障上的RAGE結(jié)合進入中樞,因此該藥可能成為理想的阻斷RAGE的新藥物[15]。 已知AGEs-RAGE是參與AD發(fā)生發(fā)展的重要因素,FPS-ZM1對RAGE介導(dǎo)的多條損傷通路有較強的抑制作用。已有研究證明FPS-ZM1對APP轉(zhuǎn)基因AD模型有明顯神經(jīng)保護作用,然而,FPS-ZM1是否對AGES誘導(dǎo)的腦神經(jīng)損傷有保護作用未見報道。因此,我們設(shè)計該課題,通過建立AGES腦損傷動物模型,進一步研究AGEs-RAGE通路的腦損傷機制及FPS-ZM1阻斷RAGE的腦保護效果和可能機制。 目的 (1)明確AGEs損傷機制,探討不同損傷通路之間可能的聯(lián)系。 (2)探討FPS-ZM1對AGES腦損傷所致海馬區(qū)Aβ異常代謝的影響。 (3)探討FPS-ZM1對AGES腦損傷所致海馬區(qū)炎性反應(yīng)的作用機制。 研究方法 (1)建立AGEs腦損傷模型,大鼠麻醉后固定于立體定位儀上,常規(guī)備皮消毒,于顱頂部正中切開皮膚。參考Miguel-Hidalg等[12]的方法,用微量注射泵海馬注射法,兩側(cè)海馬內(nèi)注射AGEs各5μ1,建立AGEs腦損傷模型。 (2)分組及造模：將40只大鼠隨機分4組(每組各10只)： a.生理鹽水組(NC組)：海馬內(nèi)注射生理鹽水。 b.FPS-ZM1對照組：海馬內(nèi)注射生理鹽水。 c.AGEs組：海馬內(nèi)注射AGEs。 d.FPS-ZM1組：海馬內(nèi)注射AGEso (3)干預(yù)方法：FPS-ZM1組和FPS-ZM1對照組：造模前1周以1mg/kg/d注射FPS-ZM1,并連續(xù)4周給藥；AGEs組、NC組：腹腔注射相同體積生理鹽水。 (4)觀察指標及檢測方法：造模3周后進行Morris水迷宮實驗,在測試期記錄每次找到平臺的時間(escape latency, EL)。水迷宮測試完成后,用免疫組化檢測各組大鼠海馬TNFα的蛋白表達,通過Western blot半定量檢測各組大鼠海馬區(qū)RAGE,β分泌酶、p-NF-κB和TNFα的表達,用ELISA法定量檢測各組大鼠海馬區(qū)Aβ1-40, Aβ1-42的表達。 結(jié)果 (1) Morris水迷宮實驗 AGES組逃避潛伏期較NC組、FPS-ZM1對照組明顯延長(P0.01),FPS-ZM1組逃避潛伏期較AGEs組明顯縮短(P0.01), FPS-ZM1組逃避潛伏期較NC組、FPS-ZM1對照組無明顯改變(P0.05)。 (2)免疫組化檢測大鼠海馬區(qū)TNFa的表達 與其他各組比較,AGEs組大鼠海馬組織可見TNFa蛋白呈棕褐色陽性表達,著色最深；FPS——ZM1組免疫反應(yīng)陽性細胞數(shù)少,染色淺；NC組、FPS——ZM1對照組海馬區(qū)幾乎沒有陽性表達,且較AGES組和FPS-ZM1組細胞排列緊密,細胞無明顯萎縮現(xiàn)象。 (3)Western blot半定量檢測各組大鼠海馬區(qū)RAGE、GD11b, pNF-KB.TNFa和p分泌酶、APP的表達 AGEs組RAGE、CD11b, pNF-KB.TNFa和β分泌酶、APP的表達明顯高于NC組.FPS-ZM1對照組(P0.01)；與AGES組比較,FPS-ZM1組上述指標表達明顯降低(P0.01)；與NC組.FPS-ZM1對照組比較,FPS-ZM1組RAGE表達無明顯差異(P0.05),但除RAGE外其他指標表達增強(P0.01)。 (4)用Elisa檢測各組大鼠海馬區(qū)Ap1-40,Aβ1-42 AGEs組海馬區(qū)Ap1-40和Ap1-42的濃度均較NC組、FPS-ZMl對照組明顯增高(P0.01)；與AGEs組,FPS-ZM1組Aβ1-40和Ap1-42的濃度明顯降低(P0.01),與NC組、FPS-ZM1對照組比較,FPS-ZM1組Ap1-40和Aβ1-42的濃度升高(P0.01) 結(jié)論 (1)AGES能通過誘導(dǎo)海馬區(qū)糖基化終末產(chǎn)物受體(RAGE)的高表達,上調(diào)P-NF-κB并可能激活BACE1,促進Aβ1-40Ap1-42生成增加。 (2)RAGE受體阻斷劑FPS-ZM1能通過阻斷細胞上RAGE,減少腦組織NF-κB的激活,從而減輕腦AGES損傷引起的炎性反應(yīng)。 (3)FPS-ZM1可能通過抑制細胞上RAGE,下調(diào)p-NF-κB,進而降低BACE1的活性和APP蛋白水平,最終減少Aβ1-40,Aβ1-42生成,改善AGES腦損傷大鼠的認知水平。該實驗證實FPS-ZM1能減少Ap生成并有抗炎作用,提示其腦保護的多效性,為今后該藥的防治AD提供有利理論依據(jù)。該藥可能將成為抑制阿爾茨海默病的有效措施。 意義 本實驗通過應(yīng)用腦立體定位技術(shù)建立大鼠AGEs海馬損傷模型,證實AGEs-RAGE通路能通過上調(diào)P-NF-κB并激活BACE1,促進Aβ生成增加,且RAGE阻斷劑FPS-ZM1能抑制AGEs模型組海馬區(qū)Ap生成及炎癥反應(yīng),進一步證實AGE-RAGE通路是參與AD發(fā)生發(fā)展的重要因素,驗證了RAGE是治療AD的有效靶點,FPS-ZM1可能成為具有潛力的防治AD的藥物。
【關(guān)鍵詞】：阿爾茨海默病 糖基化終末產(chǎn)物 RAGE阻斷劑 FPS-ZM1 淀粉樣前體蛋 白 BACE1 Aβ p-NF-κB 炎性反應(yīng)
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R749.16
【目錄】：

• 中文摘要6-11
• ABSTRACT11-16
• 符號說明16-17
• 前言17-19
• 材料與方法19-29
• 實驗結(jié)果29-30
• 討論30-38
• 結(jié)論38-39
• 附表39-43
• 附圖43-48
• 參考文獻48-56
• 創(chuàng)新點56
• 限制點56-57
• 致謝57-58
• 攻讀碩士學位研究生期間參與課題及發(fā)表的論文58-59
• 學位論文評閱及答辯情況表59

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 王瑞良;蘇青;;RAGE及其配體的臨床意義研究進展[J];國際內(nèi)分泌代謝雜志;2006年03期

2 侯芳玉,郭焱;晚期糖基化終末產(chǎn)物的檢測和臨床意義[J];國外醫(yī)學(臨床生物化學與檢驗學分冊);1999年06期

3 孫磊;楊瑩;竇彩艷;;阿爾茲海默病治療的研究進展[J];醫(yī)學信息(中旬刊);2010年07期

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本文編號：974033