本文關(guān)鍵詞：家蠶表達(dá)的霍亂病毒B亞基融合蛋白防治1型糖尿病和阿爾茨海默癥研究

  更多相關(guān)文章： 1型糖尿病 霍亂毒素B亞基 胰島素 谷氨酸脫羧酶65 口服耐受 阿爾茨海默癥 β樣淀粉蛋白 免疫療法

【摘要】：1型糖尿病(Type 1 diabetes, T1D)和阿爾茨海默癥(Alzheimer's disease, AD)是威脅人類健康的兩大疾病,二者之間存在著密切的聯(lián)系。免疫療法已被證明是一條有潛在應(yīng)用前景的防治T1D和AD有效方法。第一部分口服家蠶表達(dá)的胰島素和谷氨酸脫羧酶65雙抗原防治1型糖尿病研究1型糖尿病(Type 1 diabetes, T1D)是一種由T細(xì)胞介導(dǎo)胰島p細(xì)胞損傷的自身免疫性疫病。通過口服自身抗原誘導(dǎo)粘膜免疫耐受是預(yù)防和治療T1D的有效方法。然而誘導(dǎo)口服耐受需要大量抗原,而且功效很低,這就限制了口服耐受在臨床上的應(yīng)用。在本研究中,我們設(shè)計了包含胰島素,三拷貝的谷氨酸脫羧酶65 p531-545多肽和霍亂病毒B亞基融合蛋白(CTB-Ins-GAD/CTB-GAD-Ins),通過家蠶生物反應(yīng)器高效表達(dá)了該融合蛋白,并評價該融合蛋白對T1D的保護(hù)作用。我們的研究結(jié)果表明口服CTB-Ins-GAD可以抑制78%T1D,比單獨口服胰島素或者GAD65更有效�？诜﨏TB-Ins-GAD可以誘導(dǎo)胰島素和GAD65特異性的Th2型的免疫反應(yīng),更有利于修復(fù)Thl/Th2免疫失衡,另外,CTB-Ins-GAD可以誘導(dǎo)更多的CD4~+CD25~+Foxp3~+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞來抑制胰島素和GAD65反應(yīng)性T細(xì)胞的增殖和遷移。我們的研究結(jié)果表明聯(lián)合雙抗原結(jié)合家蠶生物反應(yīng)器能促進(jìn)口服耐受的誘導(dǎo),因此,為T1D的治療提供了一條經(jīng)濟(jì)有效的免疫療法。第二部分口服家蠶表達(dá)的霍亂毒素B亞基與雙重Aβ42融合蛋白防治阿爾茨海默癥研究阿爾茨海默癥(Alzheimer's disease, AD)的主要病理學(xué)特征包括腦中神經(jīng)細(xì)胞外β-淀粉樣多肽沉積形成的老年斑,細(xì)胞內(nèi)過度磷酸化Tau蛋白導(dǎo)致的神經(jīng)纖維纏結(jié)。Aβ是老年斑的主要成分,腦內(nèi)出現(xiàn)病理性的Ap沉積是患AD的標(biāo)志。主動或者被動免疫清除Aβ是目前被廣泛研究的有很大潛力的治療AD的方法。然而,用Aβ主動或者被動免疫提高了患腦膜炎或者引起腦出血的風(fēng)險。在本研究中,我們通過家蠶生物感應(yīng)器高效表達(dá)了包含霍亂病毒B亞基和兩個拷貝的Aβ42的融合蛋白(CTB-(Aβ42)2),并評價了該融合蛋白對AD的保護(hù)作用。我們的研究結(jié)果表明口服CTB-(Aβ42)2誘導(dǎo)非致炎的Aβ42特異性的Th2型免疫反應(yīng),顯著地降低了Aβ水平,老年斑面積和Tau蛋白的磷酸化水平,改善AD小鼠的記憶和認(rèn)知功能,但是沒有引起IL-2、IFN-γ、IL-4和IL-10等細(xì)胞因子水平的變化。我們的研究認(rèn)為CTB-(Aβ42)_2對AD有治療作用,為AD的治療提供了一條經(jīng)濟(jì)有效的免疫療法。
【關(guān)鍵詞】：1型糖尿病 霍亂毒素B亞基 胰島素 谷氨酸脫羧酶65 口服耐受 阿爾茨海默癥 β樣淀粉蛋白 免疫療法
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R587.1;R749.16
【目錄】：

• 致謝6-7
• 摘要7-9
• Abstract9-11
• 縮寫表11-17
• 第一部分 口服家蠶表達(dá)的胰島素和谷氨酸脫羧酶65雙抗原防治1型糖尿病研究17-67
• 1 引言17-21
• 1.1 1型糖尿病17-18
• 1.2 口服耐受18-19
• 1.3 聯(lián)合免疫療法19
• 1.4 本研究的目的與意義19-21
• 2 實驗材料與方法21-40
• 2.1 實驗材料21-25
• 2.1.1 實驗動物21
• 2.1.2 細(xì)胞系21
• 2.1.3 質(zhì)粒和細(xì)菌21
• 2.1.4 抗體21
• 2.1.5 實驗耗材與設(shè)備21-22
• 2.1.6 實驗試劑22
• 2.1.7 相關(guān)試劑配置22-25
• 2.2 CTB-Ins-GAD和CTB-GAD-Ins桿狀病毒的構(gòu)建實驗方法25-33
• 2.2.1 CTB-Ins-GAD和CTB-GAD-Ins融合基因的構(gòu)建25-28
• 2.2.2 PCR產(chǎn)物凝膠回收28
• 2.2.3 PCR產(chǎn)物連接PMD19-T載體28
• 2.2.4 E.coli TG1感受態(tài)細(xì)胞的制備28-29
• 2.2.5 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌(TG1或DH10)29
• 2.2.6 陽性克隆的擴(kuò)大培養(yǎng)及質(zhì)粒抽提29
• 2.2.7 陽性質(zhì)粒的酶切鑒定29-30
• 2.2.8 重組桿狀病毒質(zhì)粒(Bacmid)構(gòu)建30-31
• 2.2.9 桿狀病毒的獲得與鑒定31-33
• 2.2.9.1 家蠶卵巢細(xì)胞培養(yǎng)31-32
• 2.2.9.2 桿狀病毒(CTB-Ins-GAD/CTB-GAD-Ins)的獲得32
• 2.2.9.3 桿狀病毒(CTB-Ins-GAD/CTB-GAD-Ins)的擴(kuò)大培養(yǎng)32-33
• 2.2.9.4 桿狀病毒(CTB-Ins-GAD/CTB-GAD-Ins)感染能力測定33
• 2.2.9.5 桿狀病毒(CTB-Ins-GAD/CTB-GAD-Ins)基因組提取33
• 2.2.9.6 桿狀病毒(CTB-Ins-GAD/CTB-GAD-Ins)PCR鑒定33
• 2.3 融合蛋白的表達(dá)實驗方法33-36
• 2.3.1 融合蛋白在家蠶卵巢細(xì)胞中的表達(dá)33-34
• 2.3.2 融合蛋白在蠶蛹中的表達(dá)34
• 2.3.3 Western blot實驗方法34-35
• 2.3.4 ELlSA法測定表達(dá)量35-36
• 2.3.5 GM1-ELISA測定融合蛋白的GM1結(jié)合力36
• 2.4 口服融合蛋白防治T1D實驗方法36-40
• 2.4.1 抗體及抗體亞型滴度檢測36-37
• 2.4.2 胰腺組織切片37
• 2.4.3 口服CTB-Ins-GAD和CTB-GAD-Ins防治T1D效果檢測37
• 2.4.4 Th1/Th2細(xì)胞ELISPOT分析37-38
• 2.4.5 IL-4/IFN-γ細(xì)胞因子濃度檢測38
• 2.4.6 CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞分析38
• 2.4.7 脾臟淋巴細(xì)胞體外增值能力分析38-39
• 2.4.8 脾臟淋巴細(xì)胞體外遷移能力分析39
• 2.4.9 過繼轉(zhuǎn)移實驗方法39-40
• 3 實驗結(jié)果與分析40-64
• 3.1 獲得CTB-GAD、CTB-Ins、GAD、Ins片段40
• 3.2 構(gòu)建CTB-GAD-Ins/CTB-Ins-GAD融合基因40-41
• 3.3 構(gòu)建Bacmid(CTB-GAD-Ins/CTB-Ins-GAD)載體41-45
• 3.3.1 pBac(CTB-GAD-Ins/CTB-Ins-GAD)載體構(gòu)建和鑒定41-42
• 3.3.2 重組Bacmid質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定42-43
• 3.3.3 重組桿狀病毒的獲得及鑒定43-44
• 3.3.4 BmV-CTB-GAD-Ins和BmV-CTB-Ins-GAD病毒滴度檢測44-45
• 3.4 融合蛋白的表達(dá)及鑒定45-48
• 3.4.1 融合蛋白在家蠶細(xì)胞和蠶蛹高效表達(dá)45-46
• 3.4.2 Western Blot分析融合蛋白表達(dá)46-47
• 3.4.3 GM1結(jié)合ELISA檢測蛋白活性47-48
• 3.5 口服CTB-GAD-Ins/CTB-Ins-GAD減輕胰島炎48-50
• 3.6 口服CTB-GAD-Ins/CTB-Ins-GAD降低糖尿病發(fā)病率50-51
• 3.7 口服CTB-GAD-Ins/CTB-Ins-GAD誘導(dǎo)胰島素和GAD特異性的Th2型免疫反應(yīng)51-53
• 3.8 口服CTB-GAD-Ins/CTB-Ins-GAD誘導(dǎo)Th1向Th2型轉(zhuǎn)化53-56
• 3.9 口服CTB-GAD-Ins/CTB-Ins-GAD增加調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分化56-58
• 3.10 口服CTB-GAD-Ins/CTB-Ins-GAD抑制脾臟T細(xì)胞增殖58-60
• 3.11 口服CTB-GAD-Ins/CTB-Ins-GAD抑制脾臟T細(xì)胞遷移60-62
• 3.12 口服CTB-GAD-Ins/CTB-Ins-GAD誘導(dǎo)NOD小鼠產(chǎn)生調(diào)節(jié)性T細(xì)胞62-64
• 4 討論64-67
• 第二部分 口服家蠶表達(dá)的霍亂病毒B亞基與雙拷貝Aβ42融合蛋白防治阿爾茨海默癥研究67-99
• 1 引言67-71
• 1.1 阿爾茨海默癥67
• 1.2 阿爾茨海默癥的治療67-69
• 1.2.1 傳統(tǒng)療法67-68
• 1.2.2 免疫療法68-69
• 1.3 本研究的目的意義69-71
• 2 實驗材料與方法71-76
• 2.1 實驗材料71-72
• 2.1.1 實驗動物71
• 2.1.2 細(xì)胞系71
• 2.1.3 質(zhì)粒和細(xì)菌71
• 2.1.4 抗體71
• 2.1.5 實驗耗材與設(shè)備71
• 2.1.6 實驗試劑71-72
• 2.1.7 相關(guān)試劑配置72
• 2.2 重組病毒的構(gòu)建和鑒定實驗方法72
• 2.2.1 融合基因的構(gòu)建72
• 2.3 融合蛋白的表達(dá)與鑒定72
• 2.4 血清特異性抗體及抗體亞型的滴度檢測72
• 2.5 AD小鼠行為學(xué)檢測實驗方法72-74
• 2.5.1 水迷宮檢測72-73
• 2.5.2 曠場實驗73
• 2.5.3 Y-迷宮實驗73-74
• 2.6 小鼠腦中Aβ含量的檢測74
• 2.7 小鼠大腦老年斑塊的形態(tài)學(xué)檢測74-75
• 2.8 小鼠腦中細(xì)胞因子濃度的檢測75-76
• 3 實驗結(jié)果與分析76-97
• 3.1 構(gòu)建CTB-(Aβ42)_2融合基因76
• 3.2 構(gòu)建包含CTB-(Aβ42)_2融合基因的Bacmid載體76-79
• 3.2.1 pFastBacl載體構(gòu)建與鑒定76-77
• 3.2.2 重組Bacmid質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定77
• 3.2.3 重組桿狀病毒的獲得及鑒定77-79
• 3.2.4 BmNPV-CTB-(Aβ42)_2病毒滴度檢測79
• 3.3 重組融合蛋白的表達(dá)及鑒定79-82
• 3.3.1 重組融合蛋白在家蠶細(xì)胞和蠶蛹高效表達(dá)79-80
• 3.3.2 Western Blot分析融合蛋白表達(dá)80-81
• 3.3.3 GM1結(jié)合ELISA檢測蛋白活性81-82
• 3.4 AD小鼠血清抗體滴度檢測82-83
• 3.5 AD小鼠行為學(xué)檢測83-90
• 3.5.1 Morris水迷宮實驗83-87
• 3.5.2 曠場實驗87-88
• 3.5.3 Y-迷宮實驗88-90
• 3.6 口服CTB-(Aβ42)_2減少小鼠血清和腦組織Aβ水平檢測90-91
• 3.7 口服CTB-(Aβ42)_2減少AD小鼠大腦皮層和海馬區(qū)老年斑面積91-92
• 3.8 小鼠腦組織細(xì)胞因子檢測92-93
• 3.9 口服CTB-(Aβ42)_2改善AD小鼠PI3K/AKT信號通路93-94
• 3.10 口服CTB-(Aβ42)_2降低小鼠Tau蛋白磷酸化水平94-97
• 4 討論97-99
• 結(jié)論與展望99-100
• 參考文獻(xiàn)100-112
• 作者簡歷112

【相似文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 張志祥,姚其正;融合蛋白—— 一種新的生物工程技術(shù)[J];藥物生物技術(shù);2001年01期

2 李大鵬,王莉,衛(wèi)紅飛,張培因,吳秀麗,萬敏,王燕媚,王愛麗,楊世杰,王麗穎;熱休克蛋白65-MUC1融合蛋白對小鼠干擾素γ產(chǎn)生細(xì)胞的誘生作用[J];吉林大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2004年03期

3 曲梅花;于繼云;胡美茹;王守訓(xùn);黎燕;;人CD28-Fc融合蛋白在真核細(xì)胞中的表達(dá)與純化[J];醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)雜志;2005年05期

4 張榮媛;王靜;李茜;王航雁;;融合蛋白技術(shù)及臨床應(yīng)用進(jìn)展[J];國際生物制品學(xué)雜志;2006年02期

5 何火聰;劉樹滔;潘劍茹;陳躬瑞;饒平凡;;GST-TAT-GFP融合蛋白的表達(dá)、純化及鑒定[J];福建醫(yī)科大學(xué)學(xué)報;2006年04期

6 嚴(yán)世榮;閆瑩;孫軍;宗義強(qiáng);王小波;屈伸;;TAT-EGFP融合蛋白對小鼠生物膜穿透性的研究[J];藥物生物技術(shù);2007年05期

7 馬大龍,郭淑君,鄭蕾,陳慰峰;在大腸桿菌高效表達(dá)人白細(xì)胞介素4融合蛋白[J];北京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報;1990年04期

8 楊和平，，黃宗之;融合蛋白的生產(chǎn)技術(shù)[J];中國動脈硬化雜志;1994年04期

9 廉德君,許根俊;一種改進(jìn)的融合蛋白親和層析純化方法[J];生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展;1998年03期

10 李文平,許靜,隋建華,宋增璇;抗人纖維蛋白單鏈抗體-鏈親和素融合蛋白的穩(wěn)定性及對動物纖維蛋白的識別[J];中國免疫學(xué)雜志;1999年09期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 祝強(qiáng);黃智華;黃予良;覃揚(yáng);;rhEPO-L-Fc融合蛋白的克隆、表達(dá)、生物活性分析及初步藥代動力學(xué)研究[A];第九屆西南三省一市生物化學(xué)與分子生物學(xué)學(xué)術(shù)交流會論文集[C];2008年

2 高基民;呂建新;;白細(xì)胞介素15/鏈親和素融合蛋白的制備及活性測定[A];中國遺傳學(xué)會第八次代表大會暨學(xué)術(shù)討論會論文摘要匯編（2004-2008）[C];2008年

3 孫益;葛霽光;;人睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子和可溶性人睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子受體的融合蛋白的表達(dá)[A];中國生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)會第六次會員代表大會暨學(xué)術(shù)會議論文摘要匯編[C];2004年

4 楊振泉;劉巧泉;于恒秀;潘志明;焦新安;;新城疫病毒融合蛋白在轉(zhuǎn)基因水稻葉片中的表達(dá)及其免疫原性[A];中國生物工程學(xué)會第四次會員代表大會暨學(xué)術(shù)討論會論文摘要集[C];2005年

5 陳麗華;王強(qiáng);侯萬國;;不同鏈接劑修飾的融合谷胱甘肽活性的研究[A];中國化學(xué)會第十二屆膠體與界面化學(xué)會議論文摘要集[C];2009年

6 王榮智;汪世華;林文雄;;抗體與酶融合技術(shù)研究[A];第十屆全國殺蟲微生物學(xué)術(shù)研討會暨全國生物農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)研究與產(chǎn)業(yè)化會議論文摘要集[C];2006年

7 劉忠華;丁元生;胡忠義;;結(jié)核分枝桿菌38kD-16kD融合蛋白在大腸桿菌中的高效表達(dá)[A];2007年中國防癆協(xié)會全國學(xué)術(shù)會議論文集[C];2007年

8 祖東;徐春曉;黃國錦;姚立紅;陳愛君;朱宏建;劉沐榮;張智清;;TNFRI∶IgGFc融合蛋白基因的構(gòu)建及其在大腸桿菌中的高效表達(dá)[A];首屆長三角科技論壇——長三角生物醫(yī)藥發(fā)展論壇論文集[C];2004年

9 劉先俊;劉方欣;黎波;周輝云;王琴琴;;胸腺素α1與復(fù)合α干擾素融合蛋白的表達(dá)及其生物學(xué)活性[A];第九屆西南三省一市生物化學(xué)與分子生物學(xué)學(xué)術(shù)交流會論文集[C];2008年

10 楊燕凌;;酶(蛋白)融合技術(shù)研究[A];華東地區(qū)農(nóng)學(xué)會學(xué)術(shù)年會暨福建省科協(xié)第七屆學(xué)術(shù)年會農(nóng)業(yè)分會場論文集[C];2007年

中國重要報紙全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 記者 朱敏麗　通訊員 潘越;中國醫(yī)藥城首批融合蛋白試劑出口[N];泰州日報;2010年

2 吳紅梅;我省首批融合蛋白試劑出口美國[N];新華日報;2010年

3 金陵;融合蛋白試劑首次出口美國[N];中國醫(yī)藥報;2010年

4 記者 毛黎;美開發(fā)出癌癥治療新技術(shù)[N];科技日報;2009年

5 常麗君;線粒體融合蛋白2決定細(xì)胞生死[N];科技日報;2013年

6 通訊員 沈季 記者 張兆軍;抗腫瘤融合蛋白進(jìn)入臨床試驗[N];科技日報;2005年

7 記者 張曄　通訊員 劉寧春;一種有效治療冠心病的融合蛋白發(fā)現(xiàn)[N];科技日報;2009年

8 ;吉大抗腫瘤生物工程新藥進(jìn)入臨床試驗[N];中國高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)導(dǎo)報;2005年

9 毛磊;新型抗流感藥物有望面世[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報;2003年

10 曹麗君;英研制出新型抗流感藥物[N];中國中醫(yī)藥報;2003年

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 劉星;赭曲霉毒素A納米抗體的免疫學(xué)檢測性能及分子作用機(jī)理研究[D];南昌大學(xué);2015年

2 吳芩;Npu DnaE intein的結(jié)構(gòu)與機(jī)理研究和蛋白質(zhì)雙模式成像探針的制備及應(yīng)用[D];中國科學(xué)技術(shù)大學(xué);2015年

3 錢凱;胰高血糖素樣肽-1與人血清白蛋白融合蛋白的設(shè)計與改造[D];江南大學(xué);2015年

4 司成業(yè);基于融合蛋白構(gòu)建智能超分子組裝體[D];吉林大學(xué);2016年

5 范季瀛;候選藥物重組融合蛋白VAS-TRAIL的研究[D];華東理工大學(xué);2016年

6 高冬芳;纖維素酶作為融合蛋白在大腸桿菌中的應(yīng)用及其分泌機(jī)制的研究[D];山東大學(xué);2016年

7 宋琳琳;Ub-HBcAg-CTP融合蛋白誘導(dǎo)特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞反應(yīng)的實驗研究[D];上海交通大學(xué);2015年

8 劉寶平;家蠶表達(dá)的霍亂病毒B亞基融合蛋白防治1型糖尿病和阿爾茨海默癥研究[D];浙江大學(xué);2015年

9 周小虎;線粒體融合蛋白2在肝細(xì)胞肝癌中作用機(jī)制的研究[D];浙江大學(xué);2016年

10 陸遠(yuǎn);EGFR靶向單鏈抗體制備及介導(dǎo)siRNA內(nèi)化NSCLC細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2016年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 郭海強(qiáng);p53~(N239S)蛋白的表達(dá)與純化以及癌基因Kras~(G12D)與p53~(236S)促進(jìn)小鼠罹患肺癌[D];昆明理工大學(xué);2015年

2 胡湘云;新城疫病毒融合蛋白納米抗體的篩選與鑒定[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2015年

3 張銀閣;熒光標(biāo)記重組乙型肝炎病毒載體的構(gòu)建[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

4 彭金秀;結(jié)核分枝桿菌持續(xù)感染致T細(xì)胞功能障礙的研究及融合蛋白AEMD和LT70的構(gòu)建[D];蘭州大學(xué);2015年

5 崔連振;利用重組凝集素篩選腫瘤相關(guān)蛋白及其功能研究[D];浙江理工大學(xué);2016年

6 耿小雪;對蝦白斑綜合征病毒囊膜蛋白VP28和VP26與細(xì)胞穿膜肽的融合蛋白在畢赤酵母中的組成型表達(dá)研究[D];中國海洋大學(xué);2015年

7 皇超英;NJA-1菌中DON降解酶基因的克隆、表達(dá)及特性研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2010年

8 張冬冬;IL-1RA-PEP融合蛋白功能及對缺血性再灌注腦損傷的治療作用研究[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2016年

9 楊懿;長效GLP-1-IgG2σ Fc融合蛋白的真核表達(dá)與生物活性鑒定[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2016年

10 米夢丹;透明顫菌血紅蛋白作為可視化標(biāo)簽在蛋白純化過程中的應(yīng)用[D];吉林大學(xué);2016年

本文編號：958487