本文關鍵詞：發(fā)作性運動誘發(fā)性運動障礙PRRT2突變特征，基因型表型關系及可能機制

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【摘要】：發(fā)作性運動誘發(fā)性運動障礙(paroxysmal kinesigenic dyskinesia, PKD)是發(fā)作性運動障礙中最常見的一種,臨床表現為反復發(fā)作,運動誘發(fā),持續(xù)時間短暫的非隨意運動,如舞蹈征、手足徐動征、投擲癥、肌張力障礙等。PKD分家族性和散發(fā)性,其中家族性PKD呈常染色體顯性遺傳。PKD患者男性明顯多于女性,男女比例約為3-4：1。本病一般在兒童期或青春前期起病,30歲后癥狀多自發(fā)緩解或完全消失。發(fā)作頻率每天數次至數十次,最多可高達一百多次。我們前期研究發(fā)現PRRT2為PKD的致病基因,并得到國內外研究小組的證實。然而目前尚不清楚散發(fā)性PKD是否也攜帶PRRT2基因突變,PRRT2基因型是否與PKD臨床表型存在關系,另外PRRT2突變導致PKD的分子機制是什么也不明確。因此我們擬在前期研究基礎上進一步探討PKD患者中PRRT2基因突變特征,PKD基因型-表型間關系,并初步探討PKD的發(fā)病機制。第一部分發(fā)作性運動誘發(fā)性運動障礙散發(fā)病例PRRT2基因突變的特征目的：探討散發(fā)性PKD患者中PRRT2基因突變特征方法：共收集41例散發(fā)性PKD患者,抽取靜脈血3 mL,標準法提取DNA,Sanger法測PRRT2基因序列,PRRT2陰性者進一步篩查MR1,SLC2A1,CLCN1基因。選取18個SNPs進行單體型分析。結果：41例散發(fā)性PKD中有7例攜帶PRRT2突變,其中5例攜帶c.649dupC,1例攜帶c.649delC,1例攜帶c.133_136de1CCAG。進一步篩查父母的PRRT2基因,5例患者父親或母親一方攜帶PRRT2突變,2例患者父母均無突變。34例PRRT2陰性的PKD患者中有1例攜帶SLC2A1基因c.363GA突變,2例攜帶CLCN1基因c.1205CT突變。單體型分析證實了家系的血緣關系。結論：散發(fā)性PKD患者攜帶PRRT2基因突變的比率較低；PRRT2突變具有外顯不全,新生突變特征；臨床上應注意PKD與發(fā)作性持續(xù)運動誘發(fā)性運動障礙及先天性肌強直的鑒別診斷。第二部分發(fā)作性運動誘發(fā)性運動障礙基因型一表型關系目的：探討PKD基因型。表型關系及PRRT2突變與藥物反應關系。方法：分2階段收集81例PKD病例(家族性44例,散發(fā)性37例),Sanger法測PRRT2基因序列,采集臨床資料,患者口服卡馬西平。比較PRRT2基因突變攜帶者及非攜帶者的臨床表現差異及對卡馬西平的反應用t檢驗或卡方檢驗。結果：44例家族性患者及4例散發(fā)性患者發(fā)現4種PRRT2基因突變,包括c.514_517de1TCTG,c.649dupC,c.649delC,c.972delA。基因突變攜帶者臨床表現為舞蹈手足徐動癥(48例),而非攜帶者表現為舞蹈手足徐動癥(7例)或肌張力障礙(26例)(P=3.8×10-15)；與不攜帶基因突變的患者相比,攜帶基因突變的患者起病年齡更早(分別為7.63+3.72歲,13.52±.69歲)(P=2.2×10-11),每次PKD發(fā)作持續(xù)時間更長(P=2.2×104)；所有的突變攜帶者對小劑量卡馬西平(50mg/d)完全反應,而94%非基因突變攜帶者對相同劑量卡馬西平反應不完全(P1.1×10-20)。我們另外發(fā)現一例攜帶PRRT2基因c.649dupC突變的PKD患者同時攜帶CLCN1基因C.1723CT及c.2492AG錯義突變,提示其合并先天性肌強直。結論：PKD患者中PRRT2基因突變攜帶者較非攜帶者起病年齡更早,臨床表現更重,但對小劑量卡馬西平完全反應。當攜帶PRRT2突變的PKD患者對卡馬西平反應不完全時應篩查其他基因。第三部分利用fMRI探討發(fā)作性運動誘發(fā)性運動障礙發(fā)病相關腦區(qū)目的：利用fMRI探討發(fā)作性運動誘發(fā)性運動障礙發(fā)病相關腦區(qū)方法：收集15例攜帶PRRT2突變的PKD患者(PKDm),15例不攜帶PRRT2突變的PKD患者(PKDnm),14例正常對照,Sanger法篩查PRRT2基因序列,西門子3.0 T核磁共振進行腦部掃描。結果：與正常對照相比,PKD患者的功能網絡連接增加,而結構網絡連接減少。功能網絡分析提示PKDm組患者左側頂葉上回,顳下回,雙側中央后回由非種子區(qū)變?yōu)榉N子區(qū),而大腦的輔助運動區(qū)和背側扣帶回則由種子區(qū)變?yōu)榉欠N子區(qū)；PKDnm組患者中,雙側楔前葉和頂下葉變?yōu)榉欠N子區(qū),而額上回變?yōu)榉N子區(qū)。結構網絡分析提示PKD患者腹側扣帶回由種子區(qū)變?yōu)榉欠N子區(qū),而矩狀裂由非種子區(qū)變?yōu)榉N子區(qū)。同時,額上回在PKDm組變?yōu)榉N子區(qū),右側尾狀核和左側島葉在PKDnm組變?yōu)榉欠N子區(qū)。結論：PKD患者的功能網絡連接增加而結構網絡連接減少。軀體感覺運動整合功能的異�？赡苁荘KD的發(fā)病機制之一。第四部分發(fā)作性運動誘發(fā)性運動障礙發(fā)病機制初步探討目的：初步探討發(fā)作性運動誘發(fā)性運動障礙的發(fā)病機制方法：構建野生型(WT)及各種突變型(c.514_517delTCTG, c.649dupC, C.796CT,c.913GA,c.972delA)PRRT2慢病毒質粒,轉染SH-SY5Y細胞,提取RNA進行RT-PCR及Real Time PCR。各穩(wěn)轉細胞株用10 μmol/L胞乳素干預24 h后提取總蛋白,Western Blot檢測PRRT2蛋白改變。培養(yǎng)PKD患者及正常對照的尿液上皮細胞,利用攜帶6因子(Oct4、Sox2、cMyc、Klf4、Nanog、Lin28)的腺病毒轉染尿液上皮細胞重編程得到誘導性多能干細胞(iPS),用堿性磷酸酶活性檢測,畸胎瘤形成實驗等鑒定iPS。結果：我們成功構建野生型及突變型PRRT2慢病毒質粒并測序驗證成功,RT-PCR及Real Time PCR結果提示各突變型PRRT2細胞系與WT-PRRT2細胞mRNA水平無顯著性差異。胞乳素干預后野生型PRRT2蛋白變化不明顯,而突變型PRRT2蛋白水平明顯增加。轉染尿液上皮細胞后30天,得到形態(tài)類似ES的iPS克隆,用堿性磷酸酶活性檢測提示細胞未分化,畸胎瘤實驗提示可形成三個胚層。結論：突變型PRRT2不影響mRNA的水平但會增加蛋白的降解。利用尿液上皮細胞構建iPS方法可行,且獲得的iPS具有多項分化潛能。
【關鍵詞】：發(fā)作性運動誘發(fā)性運動障礙 PRRT2 卡馬西平 fMRI iPS
【學位授予單位】：復旦大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R749
【目錄】：

• 摘要6-9
• Abstract9-13
• 前言13-19
• 參考文獻16-19
• 第一部分 發(fā)作性運動誘發(fā)性運動障礙散發(fā)病例PRRT2基因突變特征19-36
• 材料與方法19-28
• 結果28-34
• 討論34-35
• 小結35-36
• 第二部分 發(fā)作性運動誘發(fā)性運動障礙基因型表型關系36-51
• 材料與方法36-40
• 結果40-48
• 討論48-50
• 小結50-51
• 第三部分 利用fMRI探討發(fā)作性運動誘發(fā)性運動障礙發(fā)病相關腦區(qū)51-63
• 材料與方法53-55
• 結果55-61
• 討論61-62
• 小結62-63
• 第四部分 發(fā)作性運動誘發(fā)性運動障礙發(fā)病機制初步探討63-86
• 材料與方法63-78
• 結果78-84
• 討論84-85
• 小結85-86
• 參考文獻86-91
• 全文總結91-92
• 綜述92-105
• 參考文獻98-105
• 附表105-110
• 博士期間發(fā)表論文110-111
• 致謝111-112

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