發(fā)布時間：2017-09-21 02:35

  本文關鍵詞：24-脫氫膽固醇還原酶（DHCR24）相互作用蛋白的初步篩選研究

  更多相關文章： 阿爾茲海默病 DHCR24 噬菌體展示技術

【摘要】：阿爾茨海默病(Alzheimer's diseases, AD)是一種緩慢發(fā)展的臨床上以進行性的認知損害、記憶缺失和人格改變?yōu)樘卣鞯纳窠浲诵行约膊?其與大腦及神經組織中異常的膽固醇代謝有關。24-脫氫膽固醇還原酶(DHCR24)是人體合成膽固醇最終階段的酶,能夠催化鏈甾醇還原為膽固醇。阿爾茨海默病相關蛋白24-脫氫膽固醇還原酶(DHCR24)是一個廣泛表達的,兼具膽固醇合成功能以及抗細胞凋亡等多樣化生理功能的蛋白,其神經細胞保護作用得到公認,但其在信號轉導通路中的位置和功能尚未明確。為高通量篩選與DHCR24有相互作用的蛋白質,進一步揭示DHCR24影響細胞命運的分子機制,本次實驗擬體外表達并純化獲得人源DHCR24蛋白,并在此基礎上聯合采用以DHCR24蛋白為誘餌的免疫共沉淀聯合質譜分析技術及人腦cDNA文庫T7噬菌體展示技術,初步篩選與DHCR24發(fā)生相互作用的候選蛋白。首先,我們以質粒pcDNA3.1a-DHCR24和pT7CFE1-CHis為原料構建質粒PT7CFE1-HIS-DHCR24,通過蛋白體外表達系統(tǒng)得到過表達的DHCR24蛋白。利用免疫沉淀技術用已知可以和DHCR24相互作用的MDM2蛋白驗證體外表達的DHCR24的功能；DHCR24功能得到確認后,進行免疫共沉淀聯合蛋白質譜實驗并進行分析,得到了部分可能與DHCR24相互作用的候選蛋白質。另外,我們再以體外表達得到的DHCR24進行蛋白包被,使用人腦cDNA文庫T7噬菌體展示技術,篩選與DHCR24相互作用的蛋白質。將兩部分得到的數據進行綜合分析,確定與DHCR24存在相互作用的候選蛋白質。綜上所述,本論文以pT7CFEl-HIS-DHCR24重組質粒的DHCR24蛋白體外蛋白表達及純化為基礎,證明重組質粒體外過表達的DHCR24具有良好的與其相互作用蛋白結合活性,并進行了以DHCR24蛋白為誘餌蛋白的免疫沉淀聯合質譜分析篩選DHCR24互作候選蛋白和噬菌體展示實驗并初步確定了與DHCR24相互作用的候選蛋白,為進一步研究DHCR24相互作用蛋白并理解DHCR24的神經保護作用的機制奠定了基礎。
【關鍵詞】：阿爾茲海默病 DHCR24 噬菌體展示技術
【學位授予單位】：遼寧大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R749.16
【目錄】：

• 摘要4-5
• ABSTRACT5-12
• 引言12-17
• 0.1 DHCR24蛋白的發(fā)現12-13
• 0.2 DHCR24及其保護作用13-14
• 0.3 DHCR24與P53和MDM2之間的相互作用14
• 0.4 DHCR24拓撲結構,調整機制以及甲基化方面的研究14-15
• 0.5 蛋白互作篩選技術15
• 0.6 研究的目的意義15-17
• 第1章 重組質粒PT7CFE1-His-DHCR24的構建17-27
• 1.1 引言17-18
• 1.2 實驗材料18-19
• 1.2.1 生化試劑耗材18
• 1.2.2 主要儀器設備18-19
• 1.2.3 試劑的配制19
• 1.3 實驗方法19-24
• 1.3.1 pcDNA3.1a-DHCR24和pT7CFE1-CHis質粒的轉化、擴增19-22
• 1.3.1.1 質粒轉化19-20
• 1.3.1.2 質粒小量提取20-21
• 1.3.1.3 質粒酶切驗證21
• 1.3.1.4 質粒中提擴增21-22
• 1.3.2 片段回收22-23
• 1.3.3 酶連重組23-24
• 1.3.4 重組質粒的酶切驗證和序列測定24
• 1.4 實驗結果與討論24-25
• 1.5 結論25-27
• 第2章 1-Step Human Coupled IVT Kit實現DHCR24體外表達及功能驗證27-36
• 2.1 引言27
• 2.2 實驗材料27-28
• 2.2.1 生化試劑及耗材27-28
• 2.2.2 試劑的配制28
• 2.3 實驗方法28-33
• 2.3.1 1-Step Human Coupled IVT Kit-DNA表達DHCR2428-29
• 2.3.2 Western Blot檢測DHCR24蛋白的表達29
• 2.3.3 免疫共沉淀驗證表達DHCR24功能29-33
• 2.3.3.1 N2A細胞復蘇傳代、凍存30-31
• 2.3.3.2 DHCR24與MDM2的免疫共沉淀31-32
• 2.3.2.2 Western Blot檢測DHCR24與MDM2相互作用32-33
• 2.4 結果與討論33-35
• 2.4.1 1-Step Human Coupled IVT Kit-DNA表達DHCR24的驗證33-34
• 2.4.2 Western Blot檢測DHCR24和MDM2蛋白的相互作用34-35
• 2.5 結論35-36
• 第3章 免疫共沉淀聯合質譜分析技術篩選DHCR24互作蛋白36-55
• 3.1 引言36
• 3.2 實驗材料36-37
• 3.2.1 生化試劑及耗材36-37
• 3.2.2 試劑的配制37
• 3.3 實驗方法37-43
• 3.3.1 Ad293細胞復蘇、傳代及總蛋白的提取37-39
• 3.3.1.1 Ad293細胞復蘇37-38
• 3.3.1.2 Ad293細胞傳代38
• 3.3.1.3 Ad293細胞凍存38
• 3.3.1.4 Ad293細胞總蛋白的提取38-39
• 3.3.2 1-Step Human High-Yield Mini IVT Kit表達DHCR2439-41
• 3.3.2.1 高效表達DHCR24蛋白39-40
• 3.3.2.2 BCA法測定表達DHCR24蛋白的濃度40
• 3.3.2.3 免疫共沉淀法沉淀DHCR24相互作用蛋白40-41
• 3.3.3 蛋白質譜法檢測DHCR24相互作用蛋白41-43
• 3.3.3.1 免疫共沉淀樣本的考馬斯亮藍染色41-42
• 3.3.3.2 免疫共沉淀膠點蛋白的蛋白質譜42
• 3.3.3.3 免疫共沉淀樣本全蛋白的蛋白質譜42-43
• 3.4 結果與討論43-54
• 3.4.1 免疫共沉淀樣本考馬斯染色分析43
• 3.4.2 免疫共沉淀特異條帶質譜分析43-44
• 3.4.3 免疫共沉淀全蛋白質譜鑒定差異分析44-54
• 3.5 結論54-55
• 第4章 噬菌體展示技術篩選DHCR24相互作用蛋白55-66
• 4.1 引言55
• 4.1.1 噬菌體展示技術55
• 4.1.2 藍白斑篩選55
• 4.2 實驗材料55-56
• 4.3 實驗方法56-62
• 4.3.1 大腸桿菌BLT5403的擴增和保存56-57
• 4.3.1.1 大腸桿菌BLT5403的復蘇56-57
• 4.3.1.3 大腸桿菌BLT5403的保存57
• 4.3.2 T7噬菌體的擴增和保存57
• 4.3.3 噬菌體的滴度測定57-58
• 4.3.3.1 T7原始噬菌體滴度測定57-58
• 4.3.3.2 擴增后的T7噬菌體滴度測定58
• 4.3.4 噬菌體展示技術可行性實驗58-59
• 4.3.5 陽性對照實驗59-60
• 4.3.6 DHCR24蛋白的包被和生物淘洗60-61
• 4.3.6.1 DHCR24蛋白的包被60
• 4.3.6.2 生物淘洗60-61
• 4.3.7 噬菌體篩選的PCR61
• 4.3.8 噬菌體篩選片段的TA克隆61-62
• 4.4 結果與討論62-65
• 4.4.1 人腦cDNA文庫T7噬菌體的初始濃度測定結果62
• 4.4.2 人腦cDNA文庫T7噬菌體的擴增后的濃度測定結果62
• 4.4.3 噬菌體展示技術可行性實驗結果62-63
• 4.4.4 噬菌體展示陽性對照實驗結果63
• 4.4.5 生物淘洗過程中的噬菌體滴度測定結果63-64
• 4.4.6 噬菌體篩選的PCR64-65
• 4.5 結論65-66
• 第5章 結果與展望66-68
• 致謝68-69
• 參考文獻69-71
• 攻讀學位期間發(fā)表學術論文及參加科研情況71

【參考文獻】

中國期刊全文數據庫 前2條

1 宋銘晶;董偉;全雄志;施海霞;黃瀾;張連峰;;心臟特異表達Dhcr24轉基因小鼠的建立和表型分析[J];中國比較醫(yī)學雜志;2008年05期

2 譚來勛;孫圣剛;張雙國;;不同發(fā)育時期大鼠腦海馬區(qū)膽固醇對發(fā)育與成熟的意義(英文)[J];中國臨床康復;2005年36期

，

本文編號：891889