本文關(guān)鍵詞：硒蛋白R(shí)干預(yù)阿爾茲海默癥病理過(guò)程的新機(jī)制研究

  更多相關(guān)文章： 阿爾茨海默癥(AD) 硒蛋白R(shí)(SelR) 金屬銅離子 β-淀粉樣蛋白(Aβ) 剪絲蛋白(cofilin) 肌動(dòng)蛋白(actin)

【摘要】：阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease,AD)是導(dǎo)致老年人癡呆的主要原因,已成為當(dāng)前發(fā)病率最高的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病之一。臨床上表現(xiàn)為記憶、認(rèn)知以及行為障礙,其典型病理特征包括淀粉樣蛋白(Aβ)在神經(jīng)細(xì)胞外聚集形成老年斑(senile plaque,SP)和Tau蛋白過(guò)度磷酸化后在胞內(nèi)形成的神經(jīng)纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles,NFT)。此外人們發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激、神經(jīng)元缺失及金屬離子內(nèi)穩(wěn)態(tài)失衡均與AD的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在AD患者腦組織中,含有大量的過(guò)渡金屬離子包括銅、鐵、鋅離子等。研究表明,這些金屬離子促進(jìn)Aβ的聚集和活性氧自由基(ROS)的生成,進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)元缺失等多種細(xì)胞功能的損傷。因此認(rèn)為:由金屬離子誘導(dǎo)的Aβ聚集和細(xì)胞毒性是導(dǎo)致AD形成的重要原因之一。另一方面,在AD病人的大腦額皮質(zhì)和海馬中發(fā)現(xiàn)了剪絲蛋白-肌動(dòng)蛋白(cofilin-actin)的棒狀結(jié)構(gòu),而在正常的人腦組織中未發(fā)現(xiàn)此結(jié)構(gòu),其形成與神經(jīng)退行性疾病發(fā)生有重要聯(lián)系。這說(shuō)明AD的發(fā)生可能與cofilin功能異常所引起的肌動(dòng)蛋白結(jié)構(gòu)改變有關(guān)。硒蛋白R(shí)是25種人類(lèi)硒蛋白中的一種,含有第21種必需氨基酸—硒代半胱氨酸(Sec),是一種蛋氨酸亞砜還原酶,能立體專(zhuān)一性催化還原蛋白質(zhì)中的R型蛋氨酸亞砜。因此,Sel R是一種有著特殊功能的硒蛋白,它具有活潑的氧化還原性質(zhì),并且參與到修復(fù)氧化損傷蛋白的過(guò)程中。本課題組前期研究工作發(fā)現(xiàn):Sel R對(duì)Aβ聚集和tau蛋白過(guò)度磷酸化均有干預(yù)作用。在此基礎(chǔ)上,本論文進(jìn)一步在體外研究了Sel R與金屬銅離子的結(jié)合性質(zhì)及對(duì)Aβ聚集和細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。另一方面研究了Sel R與Rho A/ROCK通路的關(guān)系。研究結(jié)果表明:Sel R可與Cu+特異性螯合劑BCA競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合Cu+,說(shuō)明Sel R具有較強(qiáng)的Cu+結(jié)合能力。通過(guò)Th T熒光實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)Cu2+/Cu+顯著抑制Aβ42的纖維化、誘導(dǎo)其形成非纖維化聚集體,而Sel R則能夠顯著抑制Cu2+/Cu+誘導(dǎo)的Aβ42聚集形態(tài)的改變;通過(guò)細(xì)胞CCK-8實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)Sel R能顯著降低Cu2+/Cu+誘導(dǎo)的Aβ42的細(xì)胞毒性。對(duì)三轉(zhuǎn)基因AD小鼠腦部海馬組織中蛋白表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示:與野生型小鼠相比,Sel R的表達(dá)量明顯下降,而Rho A/ROCK通路相關(guān)蛋白R(shí)ho A、ROCK1和p-cofilin都明顯升高;同時(shí)在N2A細(xì)胞系中,當(dāng)Sel R敲低時(shí),Rho A、ROCK1和p-cofilin也明顯升高。說(shuō)明Sel R也可以通過(guò)影響Rho A/ROCK通路來(lái)影響神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育,從而干預(yù)AD的發(fā)生發(fā)展。綜上所述,本實(shí)驗(yàn)證明了Sel R一方面可以通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合Cu2+/Cu+來(lái)抑制金屬離子誘導(dǎo)的Aβ42聚集以及細(xì)胞毒性。另一方面也可以通過(guò)作用于Rho A/ROCK通路,調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白的裝配,抑制神經(jīng)元的突觸損傷。本文從金屬離子及神經(jīng)發(fā)育的角度,研究了Sel R干預(yù)AD發(fā)生發(fā)展的新機(jī)制。
【關(guān)鍵詞】：阿爾茨海默癥(AD) 硒蛋白R(shí)(SelR) 金屬銅離子 β-淀粉樣蛋白(Aβ) 剪絲蛋白(cofilin) 肌動(dòng)蛋白(actin)
【學(xué)位授予單位】：深圳大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R749.16
【目錄】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-10
• 第1章 文獻(xiàn)綜述10-23
• 1.1 阿爾茨海默病概述10-15
• 1.1.1 AD發(fā)病機(jī)制概述10
• 1.1.2 Aβ 級(jí)聯(lián)學(xué)說(shuō)10-11
• 1.1.3 Tau蛋白學(xué)說(shuō)11-12
• 1.1.4 氧化應(yīng)激12-13
• 1.1.5 Cu~+/Cu~(2+)與AD13-14
• 1.1.6 神經(jīng)元的缺失與AD14-15
• 1.2 硒蛋白R(shí)與肌動(dòng)蛋白15-19
• 1.2.1 SelR的基本概述15-18
• 1.2.2 肌動(dòng)蛋白（actin）概述18-19
• 1.2.3 Actin與神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育19
• 1.2.4 SelR與actin的潛在關(guān)系19
• 1.3 RHOA/ROCK通路與細(xì)胞發(fā)育19-21
• 1.3.1 Rho A/ROCK通路基本介紹19-21
• 1.4 本論文的研究意義與思路21-23
• 第2章 實(shí)驗(yàn)材料及方法23-46
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料23-26
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)所用大腸桿菌菌株和細(xì)胞株23
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)所用動(dòng)物23
• 2.1.3 化學(xué)試劑及試劑盒23-25
• 2.1.4 實(shí)驗(yàn)儀器25-26
• 2.2 培養(yǎng)基及主要試劑的配制26-29
• 2.2.1 培養(yǎng)基的配置26-27
• 2.2.2 Western Blot試劑27-28
• 2.2.3 細(xì)胞免疫熒光試劑28
• 2.2.4 原代神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)試劑28
• 2.2.5 常用緩沖液和試劑的配制28-29
• 2.3 實(shí)驗(yàn)方法29-46
• 2.3.1 SelR突變體的制備29-36
• 2.3.2 Aβ_(42)樣品的處理36
• 2.3.3 Cu~+/Cu~(2+)的外理36
• 2.3.4 BCA競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合法36
• 2.3.5 ThT熒光法36-37
• 2.3.6 SelR′對(duì)Cu~+/Cu~(2+) 誘導(dǎo)的Aβ_(42)毒性的影響37-39
• 2.3.7 siRNA的設(shè)計(jì)和篩選39-41
• 2.3.8 qPCR檢測(cè)41-43
• 2.3.9 病毒感染 N2A 細(xì)胞43
• 2.3.10 海馬神經(jīng)元培養(yǎng)43-44
• 2.3.11 細(xì)胞免疫熒光44-46
• 第3章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果46-54
• 3.1 S_(EL)R′通過(guò)與Cu~+/Cu~(2+)的結(jié)合來(lái)抑制AΒ42聚集及細(xì)胞毒性46-50
• 3.1.1 SelR′表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建46
• 3.1.2 菌液PCR鑒定46-47
• 3.1.3 SelR′的表達(dá)純化47
• 3.1.4 SelR′競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合Cu~+的性質(zhì)47-48
• 3.1.5 SelR′對(duì)Cu~+/Cu~(2+)誘導(dǎo)的Aβ_(42)聚集的影響48-49
• 3.1.6 SelR′對(duì)Cu~+/Cu~(2+) 誘導(dǎo)的Aβ_(42)細(xì)胞毒性的影響49-50
• 3.2 S_(EL)R通過(guò)調(diào)節(jié)RHOA/ROCK通路影響AD50-54
• 3.2.1 鼠腦中SelR及Rho A/ROCK通路相關(guān)蛋白的差異表達(dá)50-51
• 3.2.2 N2A細(xì)胞中SelR與Rho A/ROCK通路的關(guān)系51-54
• 第4章 討論54-58
• 第5章 結(jié)論58-59
• 參考文獻(xiàn)59-66
• 致謝66-67
• 附件一、英文縮寫(xiě)對(duì)照表67

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