本文關(guān)鍵詞：β-細(xì)辛醚靶向ROCK通路抗阿爾茨海默病神經(jīng)突觸損傷的分子機制

  更多相關(guān)文章： 5月齡APP/PS1小鼠 β-細(xì)辛醚 ROCK通路 microRNA

【摘要】：研究目的：阿爾茨海默病(Alzheimer's disease, AD)是一種以進(jìn)行性認(rèn)知障礙和神經(jīng)突觸損傷為主要特征的神經(jīng)退行性疾病,以Aβ淀粉樣蛋白聚集和tau蛋白異常磷酸化形成的神經(jīng)原纖維纏結(jié)作為主要病理特征,AD早期出現(xiàn)學(xué)習(xí)和記憶能力的下降與神經(jīng)突觸受損有直接相關(guān)性,其中,與AD病因?qū)W密切相關(guān)的Aβ升高經(jīng)研究證實可促進(jìn)Rock通路的表達(dá)作用增強,出現(xiàn)神經(jīng)突觸的抑制作用,同時,Rho/ROCK通路興奮也能反向引起Aβ的異常集聚。因此,我們考慮ROCK通路作為藥物的靶點研究其作用機制。中藥石菖蒲化濕和胃,寧神益志,其性辛開苦燥溫通,芳香走竄,具開竅醒神之功,且兼化濕,豁痰,辟穢之效,常輔佐其他藥物以加強祛痰化濕之功。在前期研究中,我們發(fā)現(xiàn)石菖蒲有效成分中β-細(xì)辛醚對AD神經(jīng)突觸損傷有保護(hù)作用,對A β42的異常集聚抑制作用不明顯,同時,研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)可能與ROCK表達(dá)有關(guān),但其具體機制仍不明確。因此,本研究通過建立AD動物和細(xì)胞模型,探索β-細(xì)辛醚靶向ROCK通路對AD神經(jīng)突觸的保護(hù)作用的分子機制研究。研究方法：1.選用5月齡APP/PS1小鼠作為AD動物模型進(jìn)行實驗研究,野生型小鼠作為空白對照組,采用Morris水迷宮檢測小鼠行為學(xué)變化,用高爾基銀染,剛果紅染色從形態(tài)學(xué)上觀察小鼠大腦中海馬突觸損傷和皮質(zhì)部位β淀粉樣蛋白的沉淀情況,觀察β-細(xì)辛醚對小鼠行為學(xué)的影響和病理形態(tài)學(xué)上的作用；采用Western blot法檢測突觸相關(guān)蛋白突觸素Synapsin 1 (SYN1)和突觸后密度蛋白95抗體(PSD95)在APP/PS1小鼠海馬中的表達(dá)情況,觀察β-細(xì)辛醚對神經(jīng)突觸的保護(hù)作用；檢測ROCK通路相關(guān)蛋白(ROCK2, LIMK1)的表達(dá)情況,觀察β-細(xì)辛醚對ROCK通路的作用。2.采用miRNA基因芯片技術(shù),對APP/PS1小鼠海馬中miRNA進(jìn)行高通量篩選,并經(jīng)qRT-PCR實驗進(jìn)行有效驗證,觀察β-細(xì)辛醚對APP/PS1小鼠海馬組織中特異性表達(dá)miRNA的影響,考慮是否存在與ROCK通路等相關(guān)表達(dá)的miRNA。3.通過構(gòu)建ROCK2啟動子雙熒光素酶報告基因轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞,用A β 25-35作為處理因素,觀察β-細(xì)辛醚對ROCK2啟動子轉(zhuǎn)錄活性的作用。4.采用免疫熒光和Western blot法檢測神經(jīng)生長相關(guān)蛋白Growth Associated Protein-43 (GAP43),突觸素SYN1和Rho相關(guān)蛋白激酶2抗體(ROCK2)在AD細(xì)胞模型中的表達(dá)情況,觀察β-細(xì)辛醚對AD細(xì)胞模型的保護(hù)作用和對ROCK2的表達(dá)影響。5.通過ROCK2-siRNA和ROCK2-overexpression質(zhì)粒轉(zhuǎn)染AD細(xì)胞模型,觀察β-細(xì)辛醚依賴ROCK2的藥效作用。6.構(gòu)律特異性表達(dá)miRNA的模擬物和抑制物(如miR-335),并經(jīng)生物信息學(xué)預(yù)測后進(jìn)行WB功能性驗證,再次通過構(gòu)建ROCK2-3'UTR區(qū)含miR-335的結(jié)合位點的雙熒光素酶報告基因確定miRNA的功能。研究結(jié)果：1.β-細(xì)辛醚能有效改善5月齡APP/PS1小鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶能力。2.β-細(xì)辛醚能阻止突觸相關(guān)蛋白SYN1和PSD95在APP/PS1小鼠海馬組織中的丟失,同時能有效抑制ROCK2和LIMK1蛋白的表達(dá)。3.經(jīng)miRNA基因芯片初步篩選,與APP/PS1小鼠相比,β-細(xì)辛醚組存在上調(diào)miRNA60個,下調(diào)53個；再經(jīng)qRT-PCR檢測后,與野生型小鼠作為參照,APP/PS1小鼠中miRNA表達(dá)下調(diào)的為miR-335,表達(dá)上調(diào)的為miR-574和miR-711,而β-細(xì)辛醚處理后能有效改善其miRNA水平,其中,經(jīng)生物信息學(xué)預(yù)測miR-335, miR-574和miR-711分別與ROCK2,轉(zhuǎn)化神經(jīng)突起蛋白抗體neuritin (Nrnl)和p21激活激酶2抗體(PAK2)的mRNA有結(jié)合位點。4.β-細(xì)辛醚能有效抑制A β 25-35誘導(dǎo)的ROCK2啟動子轉(zhuǎn)錄活性的升高。5.β-細(xì)辛醚能增強A β 25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞和原代海馬神經(jīng)元中SYN1和GAP43蛋白的表達(dá),降低ROCK2的表達(dá),同時經(jīng)轉(zhuǎn)染ROCK2-siRNA和ROCK2-over expression質(zhì)粒后,β-細(xì)辛醚在沉默ROCK2后PC12細(xì)胞中SYN1表達(dá)無明顯變化,而過表達(dá)ROCK2的情況下,β-細(xì)辛醚對Aβ 25-35誘導(dǎo)PC12細(xì)胞中的SYN1表達(dá)明顯改變。6.β-細(xì)辛醚阻止miR-335下降,抑制ROCK2表達(dá)。研究結(jié)論：β-細(xì)辛醚通過抑制ROCK表達(dá)對AD神經(jīng)突觸抗損傷作用,同時亦能阻止miR-335下降,增強ROCK翻譯水平的抑制作用。
【關(guān)鍵詞】：5月齡APP/PS1小鼠 β-細(xì)辛醚 ROCK通路 microRNA
【學(xué)位授予單位】：廣州中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R749.16
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-9
• 引言9-11
• 研究背景11-27
• 第一節(jié) 阿爾茨海默病的研究進(jìn)展11-20
• 第二節(jié) Rho/ROCK通路在神經(jīng)系統(tǒng)的研究進(jìn)展20-23
• 第三節(jié) 石菖蒲防治阿爾茨海默病的研究進(jìn)展23-25
• 第四節(jié) 研究思路25-27
• 實驗部分27-78
• 第一章 β-細(xì)辛醚對APP/PS1小鼠神經(jīng)突觸損傷的保護(hù)作用27-47
• 第一節(jié) β-細(xì)辛醚改善APP/PS1小鼠空間學(xué)習(xí)和記憶能力27-29
• 第二節(jié) β-細(xì)辛醚阻止APP/PS1小鼠海馬突觸表達(dá)下降29-36
• 第三節(jié) β-細(xì)辛醚抑制APP/PS1小鼠海馬中ROCK及下游表達(dá)36-38
• 第四節(jié) β-細(xì)辛醚對APP/PS1小鼠海馬中miRNA的影響38-43
• 第五節(jié) 討論43-47
• 第二章 β-細(xì)辛醚靶向ROCK2對A β 25-35誘導(dǎo)AD細(xì)胞模型損傷的保護(hù)作用47-78
• 第-節(jié) A β 25-35對PC12細(xì)胞活性和細(xì)胞凋亡的影響47-52
• 第二節(jié) β-細(xì)辛醚抑制A β 25-35誘導(dǎo)ROCK2啟動子轉(zhuǎn)錄活性的高表達(dá)52-58
• 第三節(jié) β-細(xì)辛醚對AD細(xì)胞模型中神經(jīng)損傷的保護(hù)作用58-62
• 第四節(jié) β-細(xì)辛醚靶向ROCK2對神經(jīng)突觸的保護(hù)作用62-66
• 第五節(jié) β-細(xì)辛醚靶向特異性表達(dá)miRNA的功能驗證66-73
• 第六節(jié) 討論73-78
• 結(jié)語與展望78-79
• 參考文獻(xiàn)79-89
• 附錄89-90
• 在讀期間發(fā)表論文及參與課題情況90-91
• 致謝9

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本文編號：847413