科學研究表明,阿爾茲海默病(Alzheimer’s disease, AD)的主要病理特征是細胞外老年斑的形成和細胞內神經纖維纏結的集聚,而老年斑的主要組成成分β-淀粉樣蛋白42 (P-amyloid peptide, Aβ1-42)具神經元毒性,是AD的主要致病原因。神經干細胞(Neural Stem Cells, NSCs)是一類能自我復制,具有多向分化潛能細胞。神經干細胞的體外分離、體外培養(yǎng)、誘導分化到移植治療,為神經系統損傷、神經退行性病變的治療提供了有效的途徑。鑒于此,本研究圍繞Aβ1-42對細胞(人神經干細胞和人神經膠質瘤U251細胞)研究進行了如下工作。 利用基因重組技術構建了畢赤酵母真核表達載體pPICZaC-hAβ1-42>電轉化畢赤酵母X-33,篩選出能夠穩(wěn)定高效分泌表達重組人Aβ1-42 (rhAβ1-42)的工程菌。重組蛋白經SDS-PAGE、Western Blotting、ELISA分析,證明表達的rhAβ1-42具有生物學活性。對rhAβ1-42進行5L搖瓶水平發(fā)酵,并對其發(fā)酵條件進行優(yōu)化,rhAβ1-42表達量達到210mg·L-1。建立了一種分離...

【文章頁數】：127 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
內容提要
中文摘要
Abstract
第1章 文獻回顧
    第1節(jié) Aβ蛋白概述
        1.1 Aβ蛋白的來源和分類
        1.2 Aβ蛋白的分子結構
        1.3 Aβ蛋白與阿爾茲海默病
        1.4 Aβ蛋白的制備
    第2節(jié) 神經干細胞的研究進展
        2.1 神經干細胞的概念
        2.2 神經干細胞的來源與特性
        2.3 體外培養(yǎng)神經干細胞的應用
        2.4 轉基因神經干細胞在腦及脊髓損傷中的作用
        2.5 神經干細胞研究的前景及展望
第2章 rhAβ_1-42在畢赤酵母中的高效分泌表達及純化工藝
    2.1 材料與方法
        2.1.1 器材及設備
        2.1.2 主要試劑及配制
        2.1.3 溶液配制
        2.1.4 質粒與菌株
        2.1.5 畢赤酵母的轉化
        2.1.6 陽性菌株的篩選
        2.1.7 表達產物rhAβ_1-42分析
        2.1.8 確定畢赤酵母表達rhAβ_1-42的最佳pH值
        2.1.9 rhAβ_1-42的搖瓶水平發(fā)酵表達
        2.1.10 rhAβ_1-42的小量純化
        2.1.11 rhAβ_1-42的分析鑒定
    2.2 結果
        2.2.1 PCR方法篩選rhAβ_1-42轉化陽性菌株
        2.2.2 Tricine-SDS-PAGE篩選rhAβ_1-42表達的高峰時間
        2.2.3 SDS-PAGE篩選高表達rhAβ_1-42的工程菌
        2.2.4 畢赤酵母表達rhAβ_1-42最佳pH值的確定
    2.3 rhAβ_1-42的小量純化
        2.3.1 硫酸銨分級沉淀
        2.3.2 透析
        2.3.3 AKTA Explorer中壓層析系統純化
        2.3.4 Tricine-SDS-PAGE和Western blotting分析純化rhAβ1-42

    2.4 討論
第3章 rhAβ_1-42促進人神經干細胞凋亡作用的研究
    3.1 材料和方法
        3.1.1 器材及設備
        3.1.2 主要試劑及配制
        3.1.3 溶液配制
        3.1.4 Aβ_1-42寡聚體的制備
        3.1.5 神經干細胞和皮膚成纖維細胞的原代培養(yǎng)
        3.1.6 神經干細胞的鑒定
        3.1.7 形態(tài)學特征觀察
        3.1.8 rhAβ_1-42對神經干細胞生長作用的檢測
        3.1.9 流式細胞術檢測rhAβ_1-42對神經干細胞凋亡率的影響
        3.1.10 rhAβ_1-42致人神經干細胞的神經發(fā)生效應
        3.1.11 DNA瓊脂糖凝膠電泳
        3.1.12 超微結構分析
    3.2 結果
        3.2.1 神經干細胞和皮膚成纖維細胞的分離、培養(yǎng)和形態(tài)學觀察
        3.2.2 神經干細胞的鑒定
        3.2.3 rhAβ_1-42對神經干細胞形態(tài)的影響
        3.2.4 rhAβ_1-42對神經干細胞生長作用的檢測
        3.2.5 rhAβ_1-42對人皮膚成纖維細胞的作用
        3.2.6 rhAβ_1-42對神經干細胞凋亡率的影響
        3.2.7 DNA瓊脂糖凝膠電泳
        3.2.8 透射電子顯微鏡下觀察對神經干細胞超微結構的影響
        3.2.9 神經發(fā)生效應
    3.3 討論
第4章 rhAβ_1-42促進人神經膠質瘤U251細胞凋亡作用的研究
    4.1 材料與方法
        4.1.1 器材及設備
        4.1.2 主要試劑及配制
        4.1.3 溶液配制
        4.1.4 細胞培養(yǎng)
        4.1.5 細胞體外增殖能力測定
        4.1.6 細胞形態(tài)學觀察
        4.1.7 AO/EB觀察細胞形態(tài)學改變
        4.1.8 流式細胞術檢測rhAβ_1-42對U251細胞的凋亡作用
        4.1.9 Western blotting
        4.1.10 統計學方法
    4.2 結果
        4.2.1 rhAβ_1-42對U251細胞增殖能力的影響
        4.2.2 倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化
        4.2.3 AO/EB雙染法觀察細胞凋亡形態(tài)學改變
        4.2.4 流式細胞術分析rhAβ_1-42對U251細胞的凋亡影響
        4.2.5 Western blotting檢測不同濃度rhAβ_1-42對U251細胞凋亡蛋白bax,bcl-2的表達情況
    4.3 討論
研究總結
參考文獻
攻讀博士期間所取得科研成果
致謝



本文編號：3964469

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