發(fā)布時間：2017-05-06 08:14

  本文關鍵詞：川芎嗪烴基哌嗪衍生物CXC137對NMDA誘導的SH-SY5Y細胞損傷及血管性癡呆模型大鼠保護作用研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】： 血管性癡呆是發(fā)生在腦血管基礎上的以記憶、認知功能缺損為主,或伴有語言、視空間技能及情感或人格障礙的獲得性智能持續(xù)性損害的綜合征。血管性癡呆產(chǎn)生原因多為腦梗塞導致腦缺血-再灌注引起的腦實質損傷。當今研究表明：興奮性氨基酸毒性、自由基損傷和神經(jīng)細胞凋亡是缺血-再灌注導致的腦實質損傷進而引起血管性癡呆的主要分子生物學機制。 川芎嗪是中藥川芎的主要有效成分之一,具有清除氧自由基、鈣拮抗、擴血管、抗血小板聚集和血栓形成等多種作用,廣泛應用于臨床治療。但川芎嗪分子中的甲基易被氧化,生成極性和水溶性較大的代謝物而迅速被排出體外,所以川芎嗪存在半衰期短,生物利用度低等缺點。本課題選用的化合物CXC137,是以氟桂利嗪的主要藥效基團二苯甲基-1-哌嗪基甲基基團取代川芎嗪的藥代基團2位甲基而合成出的新型川芎嗪烴基哌嗪類衍生物。氟桂利嗪為第2代哌嗪類鈣拮抗藥,能通過血腦屏障,選擇性擴張血管,預防缺血、缺氧引起的細胞內Ca2+超載所致細胞損害,臨床上廣泛用于心腦血管疾病和外周血管功能不全的防治。以氟桂利嗪的活性基團取代川芎嗪分子的藥代基團,以期克服川芎嗪體內半衰期短、生物利用度低等缺點,并通過協(xié)同作用增強藥效,提高抗心腦血管疾病作用。 本研究第一部分以N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)作用于人神經(jīng)母細胞瘤細胞(SH-SY5Y),模擬體內興奮性氨基酸毒性造成的神經(jīng)細胞損傷,第二部分采用雙側頸總動脈結扎并降壓的方法制作大鼠血管性癡呆模型。實驗目的為從不同方面探討CXC137對NMDA誘導的神經(jīng)細胞損傷和抗凋亡的作用機制,以及對血管性癡呆模型大鼠的藥理學作用,為進一步開發(fā)該化合物治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供理論基礎。同時,以傳統(tǒng)中藥的有效成分為先導化合物,在構效關系研究的基礎上對其進行結構改造和優(yōu)化,為充分利用我國豐富的天然植物資源進行創(chuàng)新藥物研究提供依據(jù)。 1.CXC137對NMDA損傷SH-SY5Y細胞活力的影響 采用MTT法檢測細胞活力。實驗結果顯示：SH-SYSY細胞經(jīng)NMDA200μmol／L損傷后,細胞活力明顯降低(P0.01)。而溶媒組(3%oDMSO)對細胞活力無影響。同時發(fā)現(xiàn),NMDA損傷前或損傷后給予CXC137均對細胞損傷具有保護作用(P0.01)。 2.CXC137對NMDA損傷SH-SY5Y細胞LDH釋放率的影響 收集氧化損傷處理后的細胞培養(yǎng)上清液和細胞裂解液,參照試劑盒說明分別測定培養(yǎng)上清液和細胞裂解液中的LDH活性,計算細胞LDH釋放率。實驗結果表明：NMDA損傷后SH-SY5Y細胞LDH釋放率顯著增高(P0.01)。與模型組相比,CXC137處理后可明顯降低細胞LDH釋放率(P0.01)。 3.流式細胞術檢測細胞凋亡率 細胞經(jīng)處理后,以Annexin V-FITC／PI雙染后上流式細胞儀檢測。實驗結果表明,與正常組比較,模型組細胞的凋亡率明顯升高(P0.01)。與模型組比較,CXC137各濃度組細胞的凋亡率明顯降低,且呈劑量依賴性關系,差異有顯著統(tǒng)計學意義(P0.01)。 4.CXC137對NMDA損傷SH-SY5Y細胞內Caspase-3蛋白活性及表達的影響 使用Caspase-3活力檢測試劑盒和Western Blot檢測Caspase-3活力和表達。實驗結果表明：加入NMDA后,Caspase-3蛋白活性及表達均明顯升高(P0.01),CXC13720、40和80μmol／L三個劑量組均可顯著降低Caspase-3活力和蛋白表達水平(P0.05或P0.01)。 5.CXC137對NMDA損傷SH-SY5Y細胞內游離鈣濃度的影響 細胞懸液以熒光探針Fura-3／AM負載后,置多功能酶標儀檢測熒光強度,檢測波長為λem=490 nm/λex=526nm。實驗結果表明：加入NMDA損傷后細胞內鈣離子濃度升高(P0.01)。給予20、40、80μmol／L CXC137后,細胞內鈣離子濃度均顯著降低(P0.01)。 6.CXC137對NMDA損傷SH-SY5Y細胞ATP含量的影響 收集細胞裂解液,用考馬斯亮藍法定細胞內總蛋白量。按ATP含量檢測試劑盒說明書測定細胞ATP含量。實驗結果表明：加入NMDA后,細胞內ATP含量明顯降低(P0.01)。給予20、40、80μmol／L CXC137后,ATP含量顯著升高(P0.01)。 7.DPPH*法測定CXC137體外清除自由基能力 將不同濃度的抗氧化劑加入DPPH*后,在516nm處的紫外吸光度會發(fā)生改變,用以檢測化合物清除自由基的能力。實驗結果表明：50mg／ml CXC137體外自由基清除率在40%左右,具有一定的清除自由基的能力。但清除能力不如維生素E和TMP。 8.CXC137對NMDA損傷SH-SY5Y細胞MDA、GSH含量,SOD活力的影響 收集細胞裂解液,用考馬斯亮藍法定細胞內總蛋白量,按MDA、GSH、SOD檢測試劑盒說明書測定細胞內MDA、GSH含量、SOD活力。實驗結果表明：加入NMDA后,細胞內MDA生成量顯著增高(P0.01)。與NMDA組相比,40、80μmol／L CXC137組細胞內MDA生成量均明顯減少(P0.01)。加入NMDA后,細胞內SOD活力和GSH含量均顯著降低(P0.01)。與NMDA組相比,40、80μmol／L CXC137組細胞SOD活力和GSH含量均明顯升高(P0.01)。 9.CXC137對NMDA損傷SH-SY5Y細胞內NO含量和NOS活性的影響 收集細胞裂解液,用考馬斯亮藍法定細胞內總蛋白量,按NO、NOS檢測試劑盒說明書測定細胞內NO含量和NOS活性。實驗結果表明：SH-SY5Y細胞的NO含量,在NMDA損傷后開始升高,在加入NMDA后24h達到最高峰,隨后含量開始下降,加入80μmol／L CXC137和氟桂利嗪后,SH-SY5Y細胞的NO含量均有所下降。SH-SY5Y細胞的tNOS和iNOS的含量,在NMDA損傷后開始升高,在加入NMDA后12h達到最高峰,隨后含量開始下降,在36-48h時降至正常水平；加入80μmol／L CXC137和氟桂利嗪后,SH-SY5Y細胞的tNOS和iNOS含量均有所下降。 10.CXC137對血管性癡呆模型大鼠行動能力的影響 前肢抓握實驗是動物實驗中常用的檢查動物行動能力的實驗方法,方法簡便、快捷。手術后第30日經(jīng)行前肢抓握實驗用以檢測實驗大鼠行動能力,并進行評分結果表明：反復結扎雙側頸總動脈后,動物的行動能力有所降低,給予CXC137治療后,動物行動能力有所提高。 11.CXC137對血管性癡呆模型大鼠空間學習記憶能力的影響 本實驗采用Morris水迷宮檢測大鼠的空間記憶能力,包括定位航行實驗和空間探索實驗兩項檢測指標。在定位航行實驗中,模型組大鼠測試成績最差,逃避潛伏期比假手術組明顯延長(p0.01)；另外空間探索實驗中,穿越平臺次數(shù)和在平臺所在象限停留時間均顯著減少(p0.01),表明雙側頸總動脈結扎造成大鼠腦慢性缺血,4周后模型大鼠已出現(xiàn)顯著的學習記憶能力損害,而給予80mg／kgCXC137后,大鼠定位航行實驗逃避潛伏期有所降低,空間探索實驗中,穿越平臺次數(shù)和在平臺所在象限停留時間均顯著增高(p0.01)。 12.CXC137對血管性癡呆模型大鼠腦內谷氨酸含量的影響 收集實驗大鼠腦組織勻漿,用考馬斯亮藍法定細胞內總蛋白量,按谷氨酸含量檢測試劑盒說明書測定組織谷氨酸含量。實驗結果表明：雙側頸總動脈反復結扎并降壓后,大鼠腦組織勻漿中谷氨酸含量明顯升高(P0.01)。與模型組相比,20、80mg／kg CXC137能夠降低腦組織中谷氨酸含量(p0.05)。 13.CXC137對血管性癡呆模型大鼠腦內MDA、GSH含量和SOD活性的影響 收集實驗大鼠腦組織勻漿,用考馬斯亮藍法定細胞內總蛋白量,按MDA、GSH含量檢測試劑盒說明書測定組織MDA、GSH含量,按SOD活性檢測試劑盒說明書測定組織SOD活性。實驗結果表明：雙側頸總動脈反復結扎并降壓后,大鼠腦組織勻漿中MDA含量明顯升高(P0.01)；SOD活性和GSH含量明顯降低(P0.01)。與模型組相比,20、80mg／kg CXC137能夠降低腦組織中MDA含量(P0.01),80mg／kgCXC137能夠升高組織SOD活性和GSH含量(P0.01)。 14.CXC137對血管性癡呆模型大鼠腦內NO含量及NOS活性的影響 收集實驗大鼠腦組織勻漿,用考馬斯亮藍法定細胞內總蛋白量,按NO含量檢測試劑盒說明書測定組織NO含量,按NOS活性檢測試劑盒說明書測定組織NOS活性。實驗結果表明：雙側頸總動脈反復結扎并降壓4周后,大鼠腦組織勻漿中NO含量和NOS活性無顯著變化(無統(tǒng)計學差異)。 15.CXC137對血管性癡呆模型大鼠腦內線粒體的影響 線粒體懸液的渾濁度可反映線粒體腫脹度,其吸光度越高說明線粒體腫脹程度越高,線粒體損傷越嚴重。實驗結果表明：雙側頸總動脈反復結扎并降壓4周后,大鼠腦內線粒體腫脹度明顯升高(P0.01),說明雙側頸總動脈反復結扎并降壓能損傷大鼠腦線粒體；給予20,40mg／kgCXC137后,大鼠腦線粒體腫脹度顯著降低(P0.05)。
【關鍵詞】：川芎嗪烴基哌嗪衍生物 NMDA 血管性癡呆 細胞凋亡 SH-SY5Y細胞株
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R749.13
【目錄】：

• 目錄4-10
• 中文摘要10-15
• Abstract15-20
• 符號說明20-22
• 第一部分 CXC137對NMDA誘導的SH-SY5Y神經(jīng)細胞損傷的影響22-57
• 前言22-25
• 實驗材料25-28
• 實驗方法28-33
• 1.細胞培養(yǎng)28
• 2.實驗項目及檢測指標28-32
• 2.1 CXC137對NMDA損傷SH-SY5Y細胞存活力的影響28-29
• 2.1.1 MTT法檢測細胞存活力28-29
• 2.1.2 LDH釋放率測定29
• 2.2 CXC137對NMDA損傷SH-SY5Y細胞凋亡的影響29-30
• 2.2.1 流式細胞術檢測細胞凋亡率29-30
• 2.2.2 Caspase-3試劑盒檢測Caspase-3活力30
• 2.2.3 Western Blot檢測CXC137對NMDA損傷SH-SY5Y細胞內Caspase-3蛋白表達的影響30
• 2.3 CXC137對NMDA損傷SH-SY5Y細胞內游離鈣濃度的影響30-31
• 2.4 CXC137對NMDA損傷SH-SY5Y細胞內ATP含量的影響31
• 2.5 CXC137對自由基的影響31-32
• 2.5.1 DPPH~*法測定CXC137體外清除自由基能力31-32
• 2.5.2 酶生化法測定細胞內MDA、GSH含量、SOD活力32
• 2.6 細胞內NO含量和NOS活性的測定32
• 3.數(shù)據(jù)處理32-33
• 實驗結果33-49
• 1.CXC137對NMDA損傷SH-SY5Y細胞活力的影響33-36
• 1.1 CXC137對NMDA損傷SH-SY5Y細胞存活力的影響33-34
• 1.2 CXC137對NMDA損傷SH-SY5Y細胞LDH釋放率的影響34-36
• 2.CXC137對NMDA損傷SH-SY5Y細胞凋亡的影響36-40
• 2.1 流式細胞術檢測細胞凋亡率36-38
• 2.2 CXC137對NMDA損傷SH-SY5Y細胞內Caspase-3蛋白活性及表達的影響38-40
• 3.CXC137對NMDA損傷SH-SY5Y細胞內游離鈣濃度的影響40-41
• 4.CXC137對NMDA損傷SH-SY5Y細胞內ATP含量的影響41-42
• 5.CXC137對NMDA損傷SH-SY5Y細胞內自由基的影響42-46
• 5.1 DPPH~*法測定CXC137體外清除自由基能力42-43
• 5.2 CXC137對NMDA損傷SH-SY5Y細胞內MDA、GSH含量,SOD活力的影響43-46
• 5.2.1 CXC137對NMDA損傷SH-SY5Y細胞MDA含量的影響43-44
• 5.2.2 CXC137對NMDA損傷SH-SY5Y細胞內SOD活性的影響44
• 5.2.3 CXC137對NMDA損傷SH-SY5Y細胞內GSH含量的影響44-46
• 6. CXC137對NMDA損傷SH-SY5Y細胞內NO含量和NOS活性的影響46-49
• 討論49-57
• 第二部分 CXC137對血管性癡呆模型大鼠的保護作用研究57-73
• 前言57
• 實驗材料57-59
• 實驗方法59-61
• 1.實驗動物分組59
• 2.大鼠血管性癡呆模型制備及給藥59
• 3.前肢抓握實驗59
• 4.Morris水迷宮實驗59-60
• 5.生化指標檢測60-61
• 5.1 標本采集60
• 5.2 谷氨酸、MDA、GSH、NO含量,SOD、NOS活性測定60-61
• 5.3 線粒體提取及線粒體腫脹度61
• 5.3.1 線粒體提取61
• 5.3.2 線粒體腫脹度檢測61
• 6.數(shù)據(jù)處理61
• 實驗結果61-69
• 1.CXC137對血管性癡呆模型大鼠行動能力的影響61-62
• 2.CXC137對血管性癡呆模型大鼠空間學習記憶能力的影響62-64
• 3.CXC137對血管性癡呆模型大鼠腦內谷氨酸含量的影響64-65
• 4.CXC137對血管性癡呆模型大鼠腦內MDA、GSH含量和SOD活性的影響65-67
• 5.CXC137對血管性癡呆模型大鼠腦內NO含量及NOS活性的影響67-68
• 6.CXC137對血管性癡呆模型大鼠腦內線粒體的影響68-69
• 討論69-73
• 結論73-74
• 參考文獻74-79
• 致謝79-80
• 攻讀碩士學位論文期間發(fā)表的論文80-81
• 發(fā)表論文81-98
• 學位論文評閱及答辯情況表98

【引證文獻】

中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 張偉;超聲強化超臨界CO_2提取復方川芎丹參及其提取物藥效研究[D];華南理工大學;2011年

  本文關鍵詞：川芎嗪烴基哌嗪衍生物CXC137對NMDA誘導的SH-SY5Y細胞損傷及血管性癡呆模型大鼠保護作用研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：348066