帕金森�。≒arkinson’s disease,PD）現(xiàn)今已經(jīng)成為僅次于阿爾茲海默癥的第二大神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。PD的運動癥狀（運動遲緩、震顫、肌強直和姿勢步態(tài)異常）為人們所熟知,但其非運動癥狀常常被忽視;認(rèn)知障礙是最常見且具有致殘性的非運動癥狀,其中包括PD輕度認(rèn)知障礙（PD mild cognitive impairment,PD-MCI）和PD癡呆（PD dementia,PDD）,MCI是PD晚期發(fā)生癡呆的預(yù)警信號之一。研究顯示,當(dāng)診斷為PD時,將近30%患者已患有MCI;超過40%認(rèn)知功能正常的PD患者將在6年內(nèi)發(fā)展為MCI,而到了PD晚期,將近80%的患者可出現(xiàn)PDD。PDD嚴(yán)重?fù)p害患者的身心健康,顯著降低其生活質(zhì)量,給家庭和社會帶來沉重的負(fù)擔(dān)。因此,若能及時檢測和早發(fā)現(xiàn)并進行干預(yù),有利于阻止晚年癡呆的發(fā)展。但目前并無早期診斷PD認(rèn)知障礙的生物標(biāo)志物,其癥狀性治療獲益有限,也尚無充分證據(jù)表明任何一種藥物有確切的疾病修飾療效、從而延遲PD患者的認(rèn)知下降。葡萄糖腦苷酯酶（Glucocerebrosidase,GBA）功能喪失突變與PD的嚴(yán)重認(rèn)知障礙相關(guān),GBA突變的PD患者認(rèn)... 

【文章來源】：華南理工大學(xué)廣東省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

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【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

GBA調(diào)控區(qū)的SNPrs12411216鑒定

第3章結(jié)果與討論27圖3-2PD患者GBA表達(dá)量與rs12411216基因型之間的關(guān)系3.4SNPrs12411216突變顯著影響GBA基因的表達(dá)因為PD是神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，所以本實驗中使用SH-SY5Y細(xì)胞（人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞）。作為實驗后續(xù)能否成功進行的前提，細(xì)胞內(nèi)目標(biāo)基因表達(dá)的情況是十分關(guān)鍵的。為了鑒定細(xì)胞內(nèi)目標(biāo)基因表達(dá)，本研究先使用了RNA試劑盒提取了SY5Y細(xì)胞的RNA。再把提取出的RNA當(dāng)作模板,通過RT-PCR的方法來合成cDNA。之后設(shè)計PCR和瓊脂糖凝膠電泳實驗，分別把SY5Y細(xì)胞的基因組和水設(shè)置為模板的陰性對照和空白對照。以SY5Y細(xì)胞基因組、水、cDNA進行分別PCR，再將三者的PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳（圖3-3）。本研究的目的是鑒定SY5Y細(xì)胞中GBA基因的表達(dá)，所以在設(shè)計PCR和瓊脂糖凝膠電泳實驗時，本研究是以已知的GBA基因為模板設(shè)計的PCR引物，所以在PCR的過程中，只有和GBA相關(guān)的外顯子為底物才能生成PCR產(chǎn)物。因為基因組DNA中既有內(nèi)含子也有外顯子，而cDNA是由RNA逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的，只含有外顯子。本研究PCR體系中有以SY5Y細(xì)胞RNA為模板反轉(zhuǎn)錄生成的cDNA，若在cDNA的電泳道中有條帶存在，就可以證明有GBA基因的表達(dá)。本研究的凝膠電泳結(jié)果如圖3-4所示，cDNA的電泳道中有條帶存在，證明了SY5Y細(xì)胞中有GBA基因的表達(dá)。

華南理工大學(xué)碩士學(xué)位論文28圖3-3GBA基因表達(dá)鑒定電泳圖圖注：第一列為DL2000Marker，第二列為水（空白對照），第三列為基因組（陰性對照），第四列為cDNA，第五列為β-actin（內(nèi)參）為了進行靶序列的鑒定，本研究通過依據(jù)數(shù)據(jù)庫中的GBA基因DHSs片段的基因序列，在DHS兩端剪切位點各延長400bp設(shè)計引物進行PCR擴增。再對擴增產(chǎn)物進一步執(zhí)行純化操作，最后將純化的產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳。本研究就得到了如圖3-2的瓊脂糖凝膠電泳圖。本研究可以通過觀察靶序列擴增純化電泳圖中目的條帶的外觀狀況來判斷本研究之前靶序列擴增純化的結(jié)果是否良好。如圖3-5所示，目的泳道只有單一條帶，且該條帶與DL2000marker比對的大�。�1451bp）也與本研究設(shè)計的結(jié)果相吻合。該條帶外外觀條件清晰明亮，說明本研究的擴增純化結(jié)果較為良好，可以進一步將純化結(jié)果送至測序公司測序。本研究從測序公司獲得的測序結(jié)果如圖3-4所示。本研究再將本次的測序結(jié)果與數(shù)據(jù)庫中已有的GBA基因的基因序列進行比對，發(fā)現(xiàn)在整個測序結(jié)果中僅有3個位點的數(shù)據(jù)和數(shù)據(jù)庫中的基因序列存在差異，并且這三個差異位點都為于本研究DHSs片段的兩端，不在本研究的敲除范圍內(nèi)，所以對本研究的實驗結(jié)果沒有影響。由此可以證明本研究的目標(biāo)DHSs片段存在于SY5Y細(xì)胞的基因組中，且與數(shù)據(jù)庫中的基因序列吻合，該SY5Y細(xì)胞可以用于本研究下一步的敲除實驗。


本文編號：3231947