目的:MSCs的歸巢在骨折損傷修復(fù)中發(fā)揮重要的作用,非編碼微小RNA(miRNA)在MSCs歸巢中的作用仍未明確。既往研究表明補腎活血湯的石油醚提取物能有效促進(jìn)MSCs體外遷移。本研究通過補腎活血湯石油醚提取物干預(yù)MSCs,篩選差異性表達(dá)miRNA并以此為切入點,闡明補腎活血湯石油醚提取物促進(jìn)MSCs遷移過程中的關(guān)鍵miRNA在MSCs遷移的作用,為中醫(yī)藥治療骨折提供新策略和藥理靶點。方法:采用全骨髓貼壁法培養(yǎng)SD大鼠MSCs,通過細(xì)胞表面抗原流式細(xì)胞儀檢測P3代MSCs,并鑒定其成脂和成骨分化潛能。利用CCK-8法檢測補腎活血湯石油醚提取物對MSCs增殖的影響。Transwell實驗觀察補腎活血湯石油醚提取物對MSCs細(xì)胞遷移的影響,qRT-PCR檢測檢測補腎活血湯石油醚提取物對Wnt5a及JNK、PKC、CaMKII的mRNA表達(dá)的影響。并通過siRNA沉默Wnt5a觀察對MSCs遷移的影響。接著利用miRNA高通量測序技術(shù)篩選補腎活血湯石油醚提取物干預(yù)MSCs后差異表達(dá)的miRNA,結(jié)合qRT-PCR驗證篩選出差異表達(dá)的miRNA。利用miRNA mimic和inhibitor轉(zhuǎn)染MSCs后行Transwell實驗和劃痕實驗對miRNA的功能進(jìn)行驗證。利用生物信息學(xué)預(yù)測軟件進(jìn)行靶基因預(yù)測、進(jìn)行雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灪蚖estern blot檢測確定miRNA調(diào)控的靶基因。結(jié)果:流式細(xì)胞學(xué)檢測細(xì)結(jié)果顯示所培養(yǎng)P3代細(xì)胞高表達(dá)CD90和CD44(表達(dá)率97.44%和96.55%),低表達(dá)CD45和CD34(表達(dá)率0.14%和0.21%)。并且成功誘導(dǎo)形成骨細(xì)胞及脂肪細(xì)胞,符合干細(xì)胞的特性。CCK-8實驗結(jié)果顯示,各濃度組(1μg/ml、10μg/ml和100μg/ml)補腎活血湯石油醚干預(yù)都能促進(jìn)MSCs增殖。Transwell實驗表明各濃度組(1μg/ml、10μg/ml和10Cμg/ml)補腎活血湯石油醚處理后明顯促進(jìn)MSCs遷移,其中補腎活血湯石油醚促進(jìn)遷移的最佳濃度是10μg/ml。qRT-PCR結(jié)果顯示各濃度組(1μg/ml、10μg/ml 和 100μg/ml)補腎活血湯石油醚均能促進(jìn)Wnt5a及 JNK、PKC、CaMKII mRNA的表達(dá)。轉(zhuǎn)染siRNA沉默Wnt5a后,MSCs遷移能力明顯下降。miRNA高通量測序篩選出補腎活血湯石油醚干預(yù)后差異倍數(shù)大于2的miRNA有70個,其中高表達(dá)miRNA有27條,低表達(dá)miRNA有43條。對12條差異表達(dá)較大的且與細(xì)胞遷移相關(guān)的miRNA進(jìn)行qRT-PCR驗證,發(fā)現(xiàn)miR-539呈現(xiàn)低表達(dá)。Transwell實驗和劃痕實驗顯示過表miR-539能抑制MSCs遷移,低表達(dá)miR-539能促進(jìn)MSCs遷移。靶基因預(yù)測和雙熒光素報告基因檢查發(fā)現(xiàn)Wnt5a為miR-539的調(diào)控靶點。Western blot檢測結(jié)果顯示過表達(dá)miR-539能抑制Wnt5a蛋白表達(dá)。結(jié)論:補腎活血湯石油醚提取物能有效促進(jìn)MSCs增殖。補腎活血湯石油醚提取物能有效促進(jìn)MSCs遷移,其作用機制可能通過下調(diào)miR-539,靶向Wnt5a信號通路所實現(xiàn)。
【學(xué)位單位】：廣州中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R285.5

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本文編號：2886517