阿爾茨海默癥(Alzheimer's Disease,AD)是影響全球數百萬人并與年齡有關的神經性疾病。其主要的病理標志特征是β-淀粉樣蛋白(β-amyloid,Aβ)的沉積和tau蛋白的過磷酸化,分別形成細胞外斑塊和細胞內神經原纖維纏結。這個過程的許多機制細節(jié)仍然是未知的,但蛋白質聚集的一個確定結果是阿爾茨海默癥腦中的突觸功能障礙和神經元損失,包括線粒體功能障礙,氧化應激,炎癥和金屬代謝在內的不同途徑都被認為與這一過程有關。金屬離子如銅,鋅和鐵在健康和疾病狀態(tài)的大腦中均發(fā)揮重要作用,并且金屬離子在體內含量和分布的變化是不同神經退行性疾病和衰老的共同特征。阿爾茨海默癥標志性蛋白和其中的金屬結合性質可能是病理生理過程中重要的生物化學基礎。本文建立了一種基于穩(wěn)定同位素標記的對腦組織中Aβ蛋白進行絕對定量的方法。測量生物樣品中低豐度的Aβ1-40是阿爾茨海默癥研究中一個有意義的指標。以13C標記的Aβ1--40蛋白為內標,利用Aβ1-40蛋白三種抗體M3.2、4G8、11A50B的共同作用進行免疫沉淀,酸性(pH=2)70℃加熱條件下洗脫,并與基質輔助激光解吸飛行時間質譜(MALDI-TOF MS)聯用,Aβ1-40蛋白標準品回收率可達到48.7%。利用該方法和ELISA試劑盒法分別測定小鼠腦組織勻漿上清中Aβ1-40的含量,兩者沒有顯著性差異(p0.1),該方法特異性好,并且操作簡單,重復性、準確度好,更適用于市面上沒有對應ELISA試劑盒的蛋白。本文還建立了 ID-ICP-MS方法,測定小鼠腦組織的皮層、海馬、丘腦及其他腦區(qū)中的鐵、銅、鋅三種元素含量,并對檢測限、定量限、精密度、重復性、準確度進行方法學驗證。結果顯示,相比于對照鼠,模型組鼠腦中鐵、銅、鋅在不同腦區(qū)中的含量有明顯差異。銅、鋅元素主要沉積在小鼠海馬、皮層腦區(qū),而鐵元素主要沉積在小鼠海馬區(qū)域。利用ELISA方法測定模型組與對照組小鼠不同腦區(qū)中的蛋白含量,以探究與阿爾茲海默癥有關的蛋白和金屬間的關系。結果表明,Aβ1-40蛋白、Aβ1-42蛋白、淀粉樣前體蛋白(Amyloid precursor protein,APP)、tau蛋白均是海馬、皮層中的含量較高,且模型組含量高于對照組,這與鐵、銅、鋅在各腦區(qū)中的分布很類似。而金屬硫蛋白-3(Metallothionein-3,MT-3)在模型組小鼠各腦區(qū)中含量均低于對照組,且各腦區(qū)中含量差異不大。通過查閱文獻,對所得的各蛋白和金屬間的關系進行了機理方面的解釋。本文新建立了兩種方法分別定量小鼠腦組織中的蛋白和小鼠各腦區(qū)中的金屬元素,并且探究了小鼠各腦區(qū)中蛋白與金屬間的關系,為探索阿爾茲海默癥中的金屬與蛋白間的關系提供了參考,也為疾病標志物的定量研究開辟了新思路。
【學位單位】：北京化工大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R749.16
【部分圖文】：

ａｓｍａ?ｍｅｍｒａｎｅ??圖１－１?ＡＰＰ酶切生成Ａｐ蛋白示意圖??Ｆｉｇ．１－１?Ｔｈｅ?ｓｃｈｅｍａｔｉｃ?ｄｉａｇｒａｍ?ｏｆ?ＡＰＰ?ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ?ｔｏ?ｇｅｎｅｒａｔｅ?Ａｐ?ｐｒｏｔｅｉｎ．??過程中突觸正常功能的受損、喪失可能與癡呆相關，或對疾病進。密集的斑塊沉積導致周圍的神經突彎曲并改變軌跡，這可導

而形成帶上電荷的離子。此電離儀是適合測定生物大分子的軟電離方式。飛行時間質??譜儀可通過檢測生物大分子離子的質荷比，得出生物大分子的分子量信息并對生物大??分子結構進行剖析，如下圖１－２所示。??ＭＡＬＤＩ?Ｌｉｎｅａｒ?ＴＯＦ??幽?Ｉ?Ｉ??“?＾?４?ｙ?ＤＥＴＥＣＴＯＲ??Ｉ?Ｈｅａｖｙ?ｉｏｎｓ?Ｌｉｇｈｔ?ｉｏｎｓ?Ｉ??１?０?ＩＩ?丨?Ｐｅｐｔｉｄｅｓ??７Ｈｉｇｈ?ｖｏｌｔａｇｅ?Ｍａｔｒｉｘ??圖１－２?ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ?ＭＳ原理示意圖??Ｆｉｇ．?１－２?Ｔｈｅ?ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ?ｄｉａｇｒａｍ?ｏｆ?ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ?ＭＳ??ＭＡＬＤＩ分析過程中，通常情況下先將樣品（純品或混合物）和基質的溶液預先??混合，并將２？５?ｐＬ混合溶液直接點到樣品板上，要選擇適當的基體使其在激光器的??發(fā)射波長處具有大的消光系數。通常使溶劑在室溫和壓力下蒸發(fā)以產生不均勻的結晶??表面。在質譜儀內部，激光脈沖到晶體表面，基質立即升華，同時分析物分子發(fā)生解??吸和電離。然后測量分析物離子的ｍ／ｚ值。ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質譜譜圖是ｙ軸上的信號強??度圖和ｘ軸上對應的質量／電荷值。強度等級是離子的相對豐度，但是通常低于約ｍ／ｚ??５００的區(qū)域沒有被顯示，因為它被基質離子的信號飽和。純化合物的ＭＡＬＤＩ譜圖通??常以質子化分子的單電荷離子形式

完成絕對定量需要加入內標，選擇ｎＣ穩(wěn)定同位素標記的Ａ（３Ｍ〇蛋白作為內標。免疫??沉淀－ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ?ＭＳ定量蛋白原理圖??如下圖１－３所示。??Ｃ?＾?Ｃ?、??Ｘ?二?％詠?＾??ｓ???＼?＜?＾?＼?ｓ＇?＾??Ｓ－?＾??加入同位索內標?加入抗聯后的??＿織勾架丨？？髓?富集Ｈ標蛋白??，?來?ｊ、?ｊ??震?同位索內標?＾??＾?ＭＡＬＤＩ檢測?麟分離及洗滌過程??圖１－３免疫沉淀－ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦＭＳ定量蛋白原理圖??Ｆｉｇ．?１－３?Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ?ｐｒｏｔｅｉｎ?ｓｃｈｅｍａｔｉｃ?ｏｆ?Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ?－?ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ?ＭＳ??１．３?ＩＤ－ＩＣＰ＿ＭＳ測量各腦區(qū)中的金屬元素??１．３．１阿爾茲海默癥小鼠各腦區(qū)中金屬元素的分布??金屬離子在大腦中起著重要的作用，并且在不同的神經退行性疾病中也是指向其??穩(wěn)態(tài)功能障礙的有力證據，包括第一排過渡金屬，鐵，銅和鋅以及鈣等，其穩(wěn)態(tài)對于??神經功能和老化過程都很重要口］。事實上，與年齡相關的金屬離子功能障礙改變了??ＡＤ腦內有關區(qū)域中金屬離子的水平，包括在蛋白質沉積物中的累積。金屬離子與ＡＤ??病理蛋白之間的相互作用表明蛋白質錯誤折疊、聚集與金屬離子穩(wěn)態(tài)之間具有密切關??系。在ＡＤ患者中
【共引文獻】

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