研究背景： 阿爾茨海默病(AD)是一種原因不明,以進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙、行為和人格障礙等為主要臨床特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。Aβ是構(gòu)成神經(jīng)炎性斑的核心和血管沉積物的主要成分,被認(rèn)為是AD最重要的致病物質(zhì)之一。AD的病因和發(fā)病機(jī)制至今尚不清楚,越來(lái)越多的證據(jù)提示炎癥反應(yīng)在AD的病因和病理過(guò)程中具有重要作用,同時(shí)也是AD動(dòng)物模型致病的一個(gè)主要原因。胰高血糖素樣肽1(GLP-1)是由腸道內(nèi)分泌L細(xì)胞分泌的腸促胰島素,具有親神經(jīng)性,對(duì)神經(jīng)元軸突的生長(zhǎng),神經(jīng)元的營(yíng)養(yǎng)有一定的調(diào)節(jié)作用,能防護(hù)谷氨酸誘導(dǎo)的凋亡和氧化應(yīng)激損傷,可能成為具有潛在價(jià)值的治療AD的新方法。量子點(diǎn)(QDs)是一種新型的熒光分子探針,具有熒光強(qiáng)度高、激發(fā)光譜連續(xù)而寬、光學(xué)穩(wěn)定性好等優(yōu)勢(shì)。應(yīng)用量子點(diǎn)探針活體成像觀察Aβ的動(dòng)態(tài)變化及藥物對(duì)AD的療效,對(duì)阿爾茨海默病的早期診斷與早期治療具有十分重要的意義。 研究目的： 本研究通過(guò)水迷宮和分子生物學(xué)方法探討GLP-1及衍生物對(duì)AD可能保護(hù)作用及機(jī)制,利用量子點(diǎn)-抗體探針活體追蹤GLP-1干預(yù)前后AD轉(zhuǎn)基因模型Aβ的變化,探討GLP-1治療AD的療效及其神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制。研究方法：1.將正常C57BL小鼠隨機(jī)分3組：QDs組、QDs-Ap-Ab組、對(duì)照組,各組小鼠分別行量子點(diǎn)、量子點(diǎn)-Ap-Ab探針、PBS側(cè)腦室注射后,采用組織形態(tài)學(xué)和動(dòng)物行為學(xué)觀察,應(yīng)用石墨爐原子吸收光譜法檢測(cè)血、尿中鎘含量,全自動(dòng)生化檢測(cè)儀測(cè)定肝腎功能,系統(tǒng)考察量子點(diǎn)和制備的探針的生物毒性作用。 2.將飼養(yǎng)10月和16月的APP轉(zhuǎn)基因鼠、正常C57BL小鼠隨機(jī)分為：T10組、GLP-1A組、GLP-1±ExA組、正常組和T16組、GLP-1B組、GLP-1+ExB組、正常組,側(cè)腦室連續(xù)注藥后行水迷宮實(shí)驗(yàn),并取材進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察,利用ELISA方法檢測(cè)TNF-α和IL-1p蛋白含量,采用免疫組織化學(xué)和量子點(diǎn)熒光組織化學(xué)方法檢測(cè)GFAP、Aβ、GLP-1R蛋白的表達(dá),Real-time PCR檢測(cè)GLP-1R mRNA基因的表達(dá),Western blot檢測(cè)p-p38MAPK蛋白含量的變化。 3.利用動(dòng)物活體整體熒光成像系統(tǒng)和體視顯微鏡監(jiān)測(cè)T10組、T16組、GLP-1A組和正常組量子點(diǎn)探針標(biāo)記Aβ的變化,檢測(cè)3天后斷頭取腦組織冰凍切片,熒光顯微鏡觀察,驗(yàn)證Aβ的變化。 研究結(jié)果： 1、瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)到目的條帶,證明量子點(diǎn)-Ap-Ab探針制備成功。毒性檢測(cè)HE染色示QDs-Ap-Ab組海馬CA1區(qū)細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)與對(duì)照組相似；尼氏染色示探針組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)正常,尼氏體清晰可見(jiàn),與對(duì)照組無(wú)差異；石墨爐原子吸收光譜法檢測(cè)示側(cè)腦室QDs與QDs-Ap-Ab探針注射后12h,尿鎘含量較對(duì)照組明顯增加,1-7dQDs組、探針組的尿鎘含量與對(duì)照組相比,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；行為學(xué)觀察7d,三組小鼠進(jìn)食進(jìn)水正常,二便正常,無(wú)舉尾、皮膚毛發(fā)顏色改變,無(wú)步態(tài)異常、興奮抑制反應(yīng),均無(wú)死亡；QDs組和QDs-Ap-Ab組血清ALT、AST、BUN和CRE水平與對(duì)照組無(wú)明顯差異(P0.05)。 2、T10組、T16組空間學(xué)習(xí)記憶能力、思考應(yīng)變能力明顯下降；海馬神經(jīng)元受損明顯,線粒體結(jié)構(gòu)不清；IL-1p、TNFα含量明顯增多,GFAP、Aβ、GLP-1R蛋白表達(dá)明顯增高,Aβ、GLP-1R蛋白表達(dá)區(qū)域部分重疊；GLP-1RmRNA水平增高明顯；p-p38蛋白含量增多。側(cè)腦室連續(xù)5d注射GLP-1后,GLPA組小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力、思考應(yīng)變能力明顯改善,GLPB組小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力、思考應(yīng)變能力改善不明顯；GLPA組L-1p、TNFα含量較T10組明顯下降,GFAP、Aβ、GLP-1R蛋白表達(dá)明顯減少,GLP-1RmRNA水平明顯降低；p-p38蛋白含量減低。用GLP-1和Exendin Fragment9-39同時(shí)干預(yù)T10組,其空間學(xué)習(xí)記憶能力、IL-1p、TNFα含量、GFAP、Aβ、GLP-1R蛋白表達(dá)量、GLP-1RmRNA水平、p-p38蛋白含量與T10組無(wú)明顯差異。 3、NH2-QDs-605腦內(nèi)非特異性積聚較QDs-605明顯NH2-QDs-605在腦脊液中光學(xué)特性穩(wěn)定,生物相容性好。量子點(diǎn)-Ap-Ab探針標(biāo)記16月和10月轉(zhuǎn)基因鼠Ap,發(fā)現(xiàn)前者熒光范圍較后者擴(kuò)大,連續(xù)觀測(cè)3天,量子點(diǎn)熒光強(qiáng)度沒(méi)有衰減；GLP-1干預(yù)10月APP轉(zhuǎn)基因鼠5天后,其熒光范圍減小,熒光亮度降低；腦組織冰凍切片觀測(cè)驗(yàn)證了上述結(jié)果。 研究結(jié)論： 1.成功構(gòu)建了量子點(diǎn)-Ap-Ab探針,在一定的條件下,量子點(diǎn)及量子點(diǎn)-Ap-Ab探針對(duì)小鼠整體毒性作用小,生物相容性好。 2.GLP-1R在APP轉(zhuǎn)基因模型海馬組織、大腦皮層中表達(dá)增高,證實(shí)GLP-1可能通過(guò)與GLP-1R結(jié)合,參與減緩炎癥反應(yīng)、改善APP轉(zhuǎn)基因鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力。 3.GLP-1抑制腦組織中p38MAPK活化是減輕APP轉(zhuǎn)基因鼠腦內(nèi)的炎癥反應(yīng)的可能機(jī)制之一。 4.量子點(diǎn)-Ap-Ab探針可應(yīng)用于活體動(dòng)物腦內(nèi)研究,并能有效識(shí)別APP轉(zhuǎn)基因鼠腦內(nèi)的Ap沉積。 5.量子點(diǎn)-Ap-Ab探針熒光成像可以應(yīng)用于AD轉(zhuǎn)基因模型抗p淀粉樣蛋白斑塊干預(yù)的療效檢測(cè)。
【學(xué)位單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2010
【中圖分類】：R749.16
【部分圖文】：

博十學(xué)位論文第一章1.3方法1.3.1制備量子點(diǎn)一Ap一Ab探針，見(jiàn)圖1一1，)Ad沁日t.NHZ·QDs腳油Su柏，3MCC，--O咯夕、稼又l34入忿O，碩重皿黔N“·浦‘‘百‘‘.‘赴‘’產(chǎn)只‘麗了弓一健里里里鄉(xiāng)一‘N一心二。_，遙置刁龔罷井為_(kāi)《里皿卜“一“。·、丸_圖1一1量子點(diǎn)一Ap一Ab探針的制備(l)取高質(zhì)量水溶性Cdse億ns核一殼型氨基官能團(tuán)量子點(diǎn)(NHZ一QDs);(2)sulfo一SMCC(Sulfosueeinimidyl4一困一maleimidomehyl』eyelohexane小earboxylate)活化;(3)脫鹽柱純化，得到活化的氨基官能團(tuán)量子點(diǎn) (ActivatedNHZ一QDS，Ac一QDS);(4)Beta一淀粉樣膚抗體在DTT(l

1.4.2量子點(diǎn)一Ap一Ab探針對(duì)活體動(dòng)物組織形態(tài)的影響 1.4.2.1HE染色三組小鼠腦組織海馬CAI區(qū)HE染色，見(jiàn)圖1一ZA、圖1一ZB、圖1一ZC:QDs組和QDs一Ap一Ab組海馬CAI區(qū)細(xì)胞排列整齊、均勻，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，與對(duì)照組相似。圖l一4各組海馬CAI區(qū)HE染色x40oA圖:對(duì)照組B圖:QDs組C圖:QDs一Ap一Ab組1.4.2.2尼氏染色在光鏡下，QDs組和QDs一Ap一Ab組小鼠海馬CAI區(qū)示錐體細(xì)胞層神經(jīng)元排列整齊且緊密，形態(tài)正常，胞漿中尼氏體清晰可見(jiàn)，與對(duì)照組無(wú)差異。見(jiàn)圖1一3A，圖l一3B，圖l一3C。

CZ圖:QDs一p.Ab組x4001.4.3小鼠尿及血中福含量 (l)QDs組、QDs一p一Ab組和對(duì)照組尿福含量如圖1一6所示，側(cè)腦室QDs與QDs一Ap一Ab復(fù)合物探針注射后12h，尿福含量較對(duì)照組明顯增加伊獄。.01)，之后的1一7dQDs組、QDs一Ap一Ab組的尿福含量與對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 (2)QDs組、QDs一Ap一Ab組和對(duì)照組血福含量如圖1一6所示，三組血福含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。己J﹁nn乙O乙錫尿QdsQDs一Ap一Abeontrol︸︸︸、、、勺一n..玉‘1. m9z| 0.sdld 3dsd觀測(cè)時(shí)間(d)圖1石各組尿偏含童的變化注:與對(duì)照組比較， *P<0.01
【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 賈建平,賈健民,周衛(wèi)東,徐敏,楚長(zhǎng)彪,閆欣,孫永馨;Differential acetylcholine and choline concentrations in the cerebrospinal fluid of patients with Alzheimer’s disease and vascular dementia[J];Chinese Medical Journal;2004年08期

本文編號(hào)：2864622