微管相關(guān)蛋白tau的主要功能是促進(jìn)微管的組裝,維持微管的穩(wěn)定性。神經(jīng)元內(nèi)出現(xiàn)tau蛋白異常聚集體是阿爾茨海默癥(Alzheimer's disease,AD)的主要神經(jīng)病理學(xué)特征之一,且異常聚集的tau蛋白可以引起神經(jīng)元的退行性改變。細(xì)胞內(nèi)的tau蛋白主要經(jīng)泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(ubiquitin-proteasome system,UPS)和自噬-溶酶體通路(autophagy-lysosomal pathway,ALP)清除,這兩大系統(tǒng)對(duì)底物的選擇性降解都與底物的泛素化修飾直接相關(guān)。泛素C末端水解酶L1(Ubiquitin C-terminal hydrolase L1,UCH-L1)是去泛素化酶家族的成員之一,它在多聚泛素鏈的水解和泛素的循環(huán)利用過程中發(fā)揮重要作用,同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)UCH-L1還具有泛素連接酶的活性,能夠產(chǎn)生K63鏈接的泛素鏈,而K63鏈接的泛素鏈與底物蛋白的靶向結(jié)合將促進(jìn)后者經(jīng)自噬-溶酶體通路的降解,且該過程與K63和HDAC6的結(jié)合并激活HDAC6直接相關(guān)。本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn),細(xì)胞和小鼠海馬腦片水平抑制UCH-L1的活性或表達(dá),可引起tau蛋白磷酸化和泛素化修飾異常。但迄今尚無UCH-L1與tau蛋白聚集體清除之間的關(guān)系的直接報(bào)道。基于以上研究背景,我們擬以穩(wěn)定轉(zhuǎn)染人tau441異構(gòu)體的人胚腎293細(xì)胞(human embryonic kidney 293 cells stabling expressing human tau441,HEK293/tau441)為研究對(duì)象,探討UCH-L1在tau蛋白聚集體清除過程中的作用,并以K63鏈接的泛素鏈和HDAC6為靶標(biāo),對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行探討。目的:探究UCH-L1在tau蛋白聚集體清除過程中的作用及其分子機(jī)制。方法:用蛋白酶體活性抑制劑MG132處理細(xì)胞24 hr,然后洗脫含有MG132的培養(yǎng)基加入新鮮的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞24 hr,最后在洗脫MG132的同時(shí)加入U(xiǎn)CH-L1活性抑制劑LDN處理細(xì)胞24hr。上述處理結(jié)束后,利用免疫熒光技術(shù)、免疫印跡技術(shù)、免疫沉淀技術(shù)、以及HDAC6活性試劑盒檢測相關(guān)的分子生化指標(biāo)。結(jié)果:(1)MG132處理細(xì)胞24hr后,tau蛋白和聚集體形成標(biāo)志蛋白vimentin向核周聚集形成明顯的球狀聚集體;洗脫MG132 12 hr后,tau蛋白和vimentin均呈現(xiàn)出分散表達(dá)的趨勢,球狀聚集體逐漸解體;洗脫MG132 24 hr后,核周的球狀聚集體消失,tau蛋白和vimentin均勻分布在胞質(zhì);洗脫MG132加LDN處理細(xì)胞24 hr后,tau蛋白與vimentin在核周共定位,且在核周形成球狀聚集體結(jié)構(gòu)。(2)免疫印跡結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,MG132處理組中K63含量增加(P0.01);與MG132處理組相比,MG132洗脫組中K63含量降低(P0.01);與MG132洗脫組相比,MG132洗脫加LDN處理組中,K63含量進(jìn)一步降低(P0.01)。(3)免疫沉淀結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,MG132處理組中K63與HDAC6的親和力增加(P0.01);與MG132組相比,MG132洗脫組中K63與HDAC6的親和力下降(P0.01);與MG132洗脫組相比,洗脫MG132加LDN處理組中,K63與HDAC6的親和力進(jìn)一步下降(P0.05)。(4)用活性試劑盒檢測HDAC6活性變化結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,MG132組中HDAC6活性上調(diào)(P0.01);與MG132組相比,MG132洗脫組中HDAC6活性下調(diào)(P0.05);與MG132洗脫組相比,MG132洗脫加LDN處理組中HDAC6活性進(jìn)一步下調(diào)(P0.05)。同時(shí)我們也通過免疫印跡技術(shù)檢測HDAC6作用底物α-tubulin的乙�；揭苑从矵DAC6活性改變情況,發(fā)現(xiàn)其結(jié)果與試劑盒檢測結(jié)果一致。(5)免疫熒光雙標(biāo)記結(jié)果顯示,與洗脫MG132 12hr和24 hr組相比,洗脫MG132的同時(shí)加HDAC6活性抑制劑TBSA組中tau蛋白聚集體清除受阻。(6)免疫印跡結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,MG132處理組中自噬活性標(biāo)記蛋白LC3-II的含量明顯升高(P0.01);與MG132組相比,洗脫MG132組中LC3-II的含量降低(P0.01);與洗脫MG132組相比,洗脫MG132加LDN處理組中LC3-II的含量進(jìn)一步降低(P0.05)。結(jié)論:上述結(jié)果表明,蛋白酶體活性抑制可以誘導(dǎo)tau蛋白聚集體的形成;UCH-L1活性抑制可通過減少K63泛素鏈的產(chǎn)生,進(jìn)而導(dǎo)致HDAC6和自噬活性降低,最終抑制tau蛋白聚集體的清除。
【學(xué)位單位】：華中師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R749.16
【部分圖文】：

１．１蛋白質(zhì)質(zhì)重丨￡制系統(tǒng)逡逑蛋白質(zhì)是機(jī)體細(xì)胞的重要組成部分，在細(xì)胞的生命活動(dòng)中行使著重要的功能。逡逑機(jī)體細(xì)胞中的蛋白質(zhì)通過不斷的合成、降解而處于動(dòng)態(tài)平衡中，這種動(dòng)態(tài)平衡的效維持依賴于細(xì)胞中的蛋白質(zhì)質(zhì)量控制系統(tǒng)。細(xì)胞中主要的蛋白質(zhì)質(zhì)量控制系統(tǒng)括泛素－蛋白酶體系統(tǒng)（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ－ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ邋ｓｙｓｔｅｍ，邋ＵＰＳ邋）和自嗤－溶酶體通（ａｕｔｏｐｈａｇｙ－ｌｙｓｏｓｏｍａｌ邋ｐａｔｈｗａｙ，邋ＡＬＰ）［】’２］0逡逑１．１．１邋泛素－蛋白酶體系統(tǒng)（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ－ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ邋ｓｙｓｔｅｍ，邋ＵＰＳ）逡逑ＵＰＳ是ＡＴＰ依賴性的高效特異性蛋白質(zhì)降解系統(tǒng)，主要降解細(xì)胞中異常表達(dá)錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)的蛋白質(zhì)以及短周期蛋白質(zhì)［３］。ＵＰＳ參與細(xì)胞內(nèi)種代謝過程，包括細(xì)胞周期的調(diào)控，ＤＮＡ的修復(fù)，細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，轉(zhuǎn)錄，免應(yīng)答和細(xì)胞凋亡等［４＿８］。ＵＰＳ主要包括以下成分：泛素，泛素化酶，２６Ｓ蛋白酶體去泛素化酶等，其具體的作用過程分為兩步：（１）底物蛋白的泛素化修飾；（２）素化標(biāo)記的蛋白質(zhì)在２６Ｓ蛋白酶體中的降解（圖１．１）邋［９］。逡逑Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ逡逑

．１．１．４邐去泛素化酶（Ｄｅｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｎｇ邋ｅｎｚｙｍｅ，邋ＤＵＢ）逡逑去泛素化酶作為泛素－蛋白酶體系統(tǒng)的重要組成部分，在泛素的循環(huán)利用過程中逡逑起重要作用，泛素鏈在ＤＵＢ的作用下完成去泛素化過程（圖１．１）。ＤＵＢ可以通過逡逑移除泛素鏈與蛋白質(zhì)之間的連接以及泛素與泛素之間的連接，使泛素單體從蛋白質(zhì)逡逑

組蛋白去乙酷化酶（Ｈｉｓｔｏｎｅ邋ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ，邋ＨＤＡＣｓ）是一種核酶，它可以通過移逡逑除蛋白質(zhì)賴氨酸（Ｋ）殘基上共價(jià)結(jié)合的乙�；{(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的去乙�；揎�。逡逑ＨＤＡＣ６是ＨＤＡＣｓ家族中的一員，含有５個(gè)結(jié)構(gòu)域（圖１．３）邋［３４］，分別為Ｎ末端的逡逑核輸出信號(hào)結(jié)構(gòu)域（Ｎｕｃｌｅａｒ邋ｅｘｐｏｒｔ邋ｓｉｇｎａｌ，邋ＮＥＳ），去乙�；附Y(jié)構(gòu)域１邋（Ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ逡逑ｃａｔａｌｙｔｉｃ邋ｄｏｍａｉｎｌ，ＤＤ１）和去乙酸化酶結(jié)構(gòu)域２（Ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ邋ｃａｔａｌｙｔｉｃ邋ｄｏｍａｉｎ２，邋ＤＤ２），逡逑胞質(zhì)錨定結(jié)構(gòu)域邋ＳＥ１４邋（Ｓｅｒ－Ｇｌｕ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ邋ｔｅｔｒａｄｅｃａｐｅｐｔｉｄｅ邋ｒｅｐｅａｔ邋ｄｏｍａｉｎ，邋ＳＥ１４）和邋Ｃ逡逑末端的泛素－鋅指結(jié)構(gòu)域（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ邋ｚｉｎｃ邋ｆｉｎｇｅｒ邋ｄｏｍａｉｎ，邋ＢＵＺ）。Ｎ邋末端的邋ＮＥＳ逡逑結(jié)構(gòu)域使ＨＤＡＣ６從細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中［３５］，而ＳＥ１４結(jié)構(gòu)域則將ＨＤＡＣ６錨定逡逑在細(xì)胞質(zhì)中［３６］，這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的存在使得ＨＤＡＣ６成為唯一一個(gè)可定位于細(xì)胞質(zhì)中逡逑的組蛋白去乙�；�。在ＤＤ１和ＤＤ２結(jié)構(gòu)域之間含有動(dòng)力蛋白結(jié)合區(qū)結(jié)構(gòu)（ｄｙｎｅｉｎ逡逑ｍｏｔｒｏ邋ｂｉｎｄｉｎｇ，邋ＤＭＢ），該結(jié)構(gòu)能特異性的結(jié)合胞質(zhì)動(dòng)力蛋白（ｄｙｎｅｉｎ），參與細(xì)胞內(nèi)逡逑依賴于微管的物質(zhì)運(yùn)輸

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本文編號(hào)：2816420