研究背景和目的 毒品問(wèn)題是一個(gè)世界性的難題,毒品不僅造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失,更是加速了艾滋病和其他傳染病傳播,造成嚴(yán)重的社會(huì)倫理問(wèn)題乃至政治問(wèn)題。 有的學(xué)者認(rèn)為阿片類(lèi)成癮是一種慢性腦病。阿片類(lèi)藥物極強(qiáng)的成癮性以及成癮后戒毒治療的困難和長(zhǎng)期性使得在整個(gè)阿片類(lèi)物質(zhì)成癮治療過(guò)程中伴隨嚴(yán)重的急性戒斷癥狀。生理脫毒給患者帶來(lái)嚴(yán)重的生理心理痛苦,往往需要強(qiáng)制,使患者產(chǎn)生嚴(yán)重的對(duì)抗情緒,甚至喪失正常理智。因此長(zhǎng)時(shí)間且有效地緩解急性戒斷癥狀,為患者提供一個(gè)舒適的生理脫毒期關(guān)系到后續(xù)治療能否繼續(xù),將影響整個(gè)戒毒治療成功與否。 到目前為止目前國(guó)際上常用的毒癮處置方法仍是用合成的阿片類(lèi)鎮(zhèn)痛藥和低成癮性的美沙酮替代、遞減療法或?qū)⒁恍┧^的“軟性”毒品合法化以減少社會(huì)問(wèn)題。更有激進(jìn)者主張對(duì)成癮患者使用顱內(nèi)與成癮相關(guān)的神經(jīng)核團(tuán)永久毀損的方法來(lái)治療阿片類(lèi)物質(zhì)成癮。而其它治療方法也僅限于在短時(shí)間控制或暫時(shí)減輕急性戒斷癥狀。這些措施難使受到毒品長(zhǎng)期侵襲的肌體回復(fù)到正常,而且導(dǎo)致原來(lái)劇烈的急性戒斷癥狀轉(zhuǎn)為慢性稽延性戒斷癥狀。對(duì)生理成癮機(jī)制的深入研究提示,內(nèi)源性β-EP的不足特別是與成癮相關(guān)腦區(qū)神經(jīng)核團(tuán)β-EP相對(duì)不足,是阿片類(lèi)戒斷癥狀產(chǎn)生的重要神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制之一,而且可能與情緒心理依賴(lài)形成有關(guān)。有研究報(bào)道,可以通過(guò)向中樞直接補(bǔ)充β-內(nèi)啡肽而減輕戒斷癥狀。但直接補(bǔ)充外源性β-內(nèi)啡肽的方法存在著有效作用時(shí)間短暫和反復(fù)多次中樞注射容易造成損傷感染和治療成本高昂等缺陷。 腺病毒載體具有高效地傳遞和表達(dá)基因的能力,但其主要缺點(diǎn)是引起機(jī)體的免疫反應(yīng),進(jìn)入體內(nèi)3-4周后基本消失。然而正是機(jī)體的免疫系統(tǒng)逐步清除腺病毒,使靶基因的表達(dá)梯度下降,用于急性脫毒治療時(shí)恰好可以提供給機(jī)體一個(gè)自我調(diào)節(jié)的時(shí)間窗,有利于機(jī)體內(nèi)源性?xún)?nèi)啡肽物重新達(dá)到平衡狀態(tài)。表達(dá)β-EP的重組腺病毒Ad-NEP基因治療阿片類(lèi)成癮可同時(shí)滿(mǎn)足替代療法、遞減療法兩個(gè)層面,因此我們提出使用重組腺病毒Ad-NEP來(lái)治療SD大鼠急性嗎啡戒斷綜合征。這個(gè)思路巧妙地利用了腺病毒在其它基因治療中的缺點(diǎn),把它的這種會(huì) 被免疫系統(tǒng)最終清除的特征作為一種避免外來(lái)基因長(zhǎng)期作用于機(jī)體的途徑。本課題基于以上思路,從病毒表達(dá)產(chǎn)物對(duì)離體器官的影響;腺病毒的給藥途徑、劑量、目的基因在大鼠腦脊液內(nèi)的表達(dá)量與戒斷行為學(xué)評(píng)分指標(biāo)之間的相關(guān)性以及對(duì)體重指標(biāo)變化的影響做了初步探討。 方法 一.用皮下注射5日劑量逐步遞增法,建立大鼠急性嗎啡成癮模型。 二.感染Ad-NEP的HEK293細(xì)胞表達(dá)的β-EP對(duì)急性嗎啡成癮大鼠離體回腸戒斷性收縮的治療作用。 1.Ad-NEP和空腺病毒分別感染HEK293細(xì)胞,常規(guī)培養(yǎng)至第5天,收集上清液。放射免疫分析(RIA)法測(cè)定上清液中β-EP濃度,Krebs液稀釋上清液20倍,作為實(shí)驗(yàn)離體回腸的水浴液。 2.實(shí)驗(yàn)分四組。A組離體回腸水浴液由Krebs液構(gòu)成,B組離體回腸水浴液由Krebs液+感染Ad-NEP的細(xì)胞上清(含有β-EP)構(gòu)成,C組離體回腸水浴液由Krebs液+感染空病毒的細(xì)胞上清(不含β-EP)構(gòu)成,D組離體回腸水浴液仍由Krebs液構(gòu)成。A組為陰性對(duì)照組,D組為正常對(duì)照組。靜息張力Ig平衡30min后,水浴液中加入納洛酮。頸椎脫臼處死大鼠,取末端回腸制備成1.5cm長(zhǎng)短的離體回腸標(biāo)本。離體回腸基本外環(huán)境為37℃、Krebs液水浴液或Krebs液+細(xì)胞上清水浴液。所有水浴液均用95%O2+5%CO2混合氣體飽和。各實(shí)驗(yàn)組測(cè)定離體回腸在納洛酮促發(fā)下的前后張力與收縮情況,推斷影響各實(shí)驗(yàn)組收縮特征變化的因素。 三.重組腺病毒Ad-NEP對(duì)急性嗎啡成癮大鼠戒斷綜合癥的影響 1.篩選適用于大鼠側(cè)腦室注射的病毒劑量。制備5×107、5×108、5×109、5×1010、5×1011PFU五種不同滴度的Ad-NEP溶液30μl,分別注入健康正常大鼠側(cè)腦室,在注射后第4天采集大鼠腦脊液并其中β-EP濃度。另設(shè)一組注射生理鹽水的正常對(duì)照組。統(tǒng)計(jì)分析各個(gè)不同濃度組以及正常對(duì)照組的大鼠腦脊液β-EP濃度值,以病毒滴度對(duì)數(shù)值與腦脊液β-EP濃度值作相關(guān)性分析,推定適合大鼠側(cè)腦室注射的病毒滴度并討論表達(dá)物與所注射病毒滴度的相關(guān)性。 2.不同劑量Ad-NEP側(cè)腦室注射對(duì)急性嗎啡成癮大鼠戒斷癥狀的影響。 (1)建立急性嗎啡成癮大鼠模型,隨機(jī)分為四組:5×1010PFU組、5×109PFU組、Sham組、自然戒斷組。除自然戒斷組外,其余各組成癮大鼠均于成癮第5日晚向側(cè)腦室注射不同滴度Ad-NEP或生理鹽水。各組大鼠分別于術(shù)后第1、4、8、12天用納洛酮促發(fā)戒斷癥狀,由不知實(shí)驗(yàn)分組的人員根據(jù)改良的Maldonado戒斷癥狀評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)大鼠進(jìn)行戒斷行為學(xué)評(píng)分,并在評(píng)分后立即采集大鼠腦脊液標(biāo)本以測(cè)定β-EP濃度。 (2)統(tǒng)計(jì)分析各組大鼠觀(guān)察期內(nèi)每個(gè)標(biāo)本采集時(shí)間點(diǎn)腦脊液中β-EP濃度值、戒斷行為學(xué)評(píng)分的差異以及整個(gè)觀(guān)察期兩個(gè)指標(biāo)的變化程度并分析其相關(guān)性。 (3)觀(guān)察期內(nèi)每天測(cè)量記錄每只大鼠體重,統(tǒng)計(jì)分析每組大鼠體重變化的趨勢(shì)和觀(guān)察期結(jié)束時(shí)體重缺失程度的差異。最后各組實(shí)驗(yàn)大鼠死亡率行卡方檢驗(yàn)。 結(jié)果 一.成功建立急性嗎啡成癮的大鼠活體模型。 二.1.獲得β-EP濃度為7575pg/mg的細(xì)胞培養(yǎng)上清液。 2.成功制備了急性嗎啡成癮大鼠的離體回腸標(biāo)本。盡可能地縮短離體回腸熱缺血時(shí)間對(duì)收縮力的影響。納洛酮干預(yù)前,各成癮大鼠離體回腸收縮力與正常大鼠離體回腸收縮力相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),提示急性嗎啡成癮大鼠的回腸收縮力高于正常大鼠。納洛酮干預(yù)前后的收縮力,陰性對(duì)照組、Krebs液+Ad-NEP感染上清組干預(yù)前后收縮力有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.01);Krebs液+空病毒感染上清組、正常對(duì)照組干預(yù)前后收縮力無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。在觀(guān)察期內(nèi)沒(méi)有觀(guān)察到納洛酮對(duì)正常大鼠離體回腸引起特異性的戒斷性收縮,而其它三組都觀(guān)察到了戒斷性收縮,Krebs液+Ad-NEP感染上清組戒斷性收縮的次數(shù)明顯少于另外兩組,數(shù)據(jù)有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.01)。提示用含β-EP的水浴液孵育后,可以減輕納洛酮促發(fā)急性嗎啡成癮大鼠離體回腸戒斷性收縮的程度和次數(shù)。 三.1.對(duì)于正常大鼠,滴度5×1011PFU劑量病毒注射有較高死亡率,不宜使用。滴度5×109PFU、5×1010PFU兩組實(shí)驗(yàn)大鼠在注射后第4天腦脊液中β-EP濃度值均高于其他實(shí)驗(yàn)組,數(shù)據(jù)差別有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.01)。 2.經(jīng)組內(nèi)單因素方差分析,觀(guān)察期內(nèi)兩個(gè)注射病毒組第4天β-EP濃度值最高,之后開(kāi)始下降,而Sham組和自然戒斷組在第12天達(dá)到最高,但遠(yuǎn)低于兩個(gè)病毒注射組,數(shù)據(jù)差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.01)。容量30μl、滴度5×109-10PFU劑量Ad-NEP側(cè)腦室注射可以顯著地降低急性嗎啡成癮大鼠在第4天的戒斷行為學(xué)評(píng)分(P0.01),而另兩組則在第12天才有顯著下降(P0.01)。腦脊液β-EP濃度值與大鼠戒斷行為學(xué)評(píng)分間存在負(fù)相關(guān),第4天相關(guān)性最大,隨時(shí)間推移相關(guān)性減小。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)病毒注射組體重丟失百分比明顯少于Sham組和自然戒斷組,數(shù)據(jù)有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.01);各組大鼠死亡率也有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.01)。提示Ad-NEP側(cè)腦室注射可以減輕大鼠戒毒期間的體重丟失,也可降低急性嗎啡成癮大鼠自然戒斷的死亡率。 結(jié)論 一.重組腺病毒表達(dá)的β-EP能有效對(duì)抗納洛酮所促發(fā)的急性嗎啡成癮大鼠離體回腸的痙攣性戒斷收縮,可在器官水平緩解阿片類(lèi)戒斷綜合癥。 二.容積30μl,滴度5×109-10PFU是比較適合大鼠側(cè)腦室注射的病毒劑量。β-EP濃度值與所注射病毒的滴度對(duì)數(shù)值呈正相關(guān)。此劑量可以使實(shí)驗(yàn)大鼠腦脊液獲得高濃度β-EP,同時(shí)也不會(huì)在實(shí)驗(yàn)中造成實(shí)驗(yàn)大鼠大量死亡。 三.側(cè)腦室注射Ad-NEP,可以改善納洛酮誘發(fā)的急性嗎啡成癮大鼠的戒斷癥狀。大鼠急性脫毒早期戒斷行為學(xué)評(píng)分下降與Ad-NEP所引起腦脊液β-EP濃度大幅度增高具有相關(guān)性,可能通過(guò)補(bǔ)充相關(guān)腦區(qū)β-EP來(lái)起作用,但這種相關(guān)性隨時(shí)間推移而下降,推斷在生理脫毒早期腦內(nèi)相關(guān)腦區(qū)的β-EP缺失是引起急性戒斷綜合癥的主要矛盾,而后期β-EP角色的重要性下降。
【學(xué)位單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2009
【中圖分類(lèi)】：R749.64
【部分圖文】：

表示與正�；啬c+Krebs 液組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 P＜0.01；㥮表示與正�；啬c+Krebs 液+Ad-NEP 組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 P＜0.01；▲表示干預(yù)前后組內(nèi)相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 P＜0.01；圖 2：納洛酮干預(yù)前后各實(shí)驗(yàn)組回腸收縮力的變化

A組促發(fā)前后（成癮回腸+Krebs液）

B組干預(yù)前后（成癮回腸+Krebs液+Ad-NEP感染上清）

【參考文獻(xiàn)】

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