【摘要】：阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)即老年性癡呆,是一種原發(fā)性神經(jīng)退行性疾病,主要表現(xiàn)為進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙,學(xué)習(xí)、記憶功能的喪失,晚期出現(xiàn)嚴(yán)重癡呆。目前,全球約有3560萬AD患者。 AD典型病理特征之一是腦內(nèi)出現(xiàn)高密度的老年斑。研究表明,老年斑的主要成分是由39-43個(gè)氨基酸組成的淀粉樣β蛋白(Amyloidβ-protein,Aβ)。全長Aβ片段的神經(jīng)毒性作用已有廣泛報(bào)道,但Aβ神經(jīng)毒性作用的活性中心和作用機(jī)制仍存在很大爭議。已有大量實(shí)驗(yàn)表明,Aβ25-35是全長Aβ分子中一個(gè)較短的活性片段。本研究室在以往的研究中發(fā)現(xiàn),另外一個(gè)由5個(gè)氨基酸組成的短肽Aβ31-35也能在細(xì)胞培養(yǎng)、離體膜片鉗和在體電生理實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出與Aβ25-35類似的神經(jīng)毒性作用。提示:31-35序列可能是Aβ分子中的一個(gè)更短的活性片段。然而,Aβ31-35是否在行為學(xué)上也能影響大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能尚未見報(bào)道。 AD的另一個(gè)病理特征是基底前腦膽堿能神經(jīng)元大量丟失。AD患者腦內(nèi),特別是在與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)的大腦皮層和海馬內(nèi),已發(fā)現(xiàn)煙堿型乙酰膽堿受體(nicotinic acetylcholine receptors, nAChRs)數(shù)量的明顯減少。哺乳動(dòng)物腦內(nèi)的nAChRs廣泛參與各種生理過程,包括學(xué)習(xí)和記憶等認(rèn)知功能。最常見的nAChRs亞型有α4β2-nAChRs和α7-nAChRs,據(jù)報(bào)道,Aβ能夠引起膽堿能系統(tǒng)功能紊亂和認(rèn)知功能缺陷。我們?cè)谝酝难芯恐幸舶l(fā)現(xiàn)α4β2-nAChRs參與了Aβ所引起的海馬長時(shí)程增強(qiáng)(long-term potentiation, LTP)的壓抑。近年來,一些研究表明α7 nAChRs在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育、分化以及病理過程中發(fā)揮著十分重要的作用,而且,Aβ1-42與α7 nAChRs有更高的親和力。因此,α7 nAChRs可能在AD的發(fā)病或Aβ的毒性作用中具有更加重要的病理意義。然而,有關(guān)α7 nAChRs的報(bào)道目前仍然存在著很大爭議。例如,有報(bào)道顯示,AD病人腦內(nèi)α7 nAChR亞型蛋白以及mRNA明顯升高;非選擇性的nAChR激動(dòng)劑nicotine增強(qiáng)了Aβ1-40對(duì)在體海馬LTP的壓抑作用。但也有報(bào)道表明,α7 nAChRs的缺失加重了AD動(dòng)物模型中Aβ的沉積和早期的認(rèn)知功能缺失。可見,α7 nAChRs在Aβ引起的海馬LTP以及空間學(xué)習(xí)記憶功能損傷中的作用仍然需要證實(shí)。 因此,本實(shí)驗(yàn)利用電生理和行為學(xué)實(shí)驗(yàn)手段,采用側(cè)腦室給予Aβ25-35、Aβ31-35及α7 nAChRs特異性的激動(dòng)劑choline和拮抗劑MLA的方法,觀察了Aβ31-35對(duì)大鼠海馬突觸可塑性和空間學(xué)習(xí)記憶行為學(xué)的影響,探討了Aβ所致神經(jīng)毒性中的α7 nAChRs機(jī)制,旨在為AD的發(fā)病機(jī)制以及AD的防治提供可能的新思路。實(shí)驗(yàn)具體分為以下兩部分: 目的:本實(shí)驗(yàn)通過急性側(cè)腦室內(nèi)注射Aβ25-35、Aβ31-35以及α7 nAChRs特異性的激動(dòng)劑choline和拮抗劑MLA,記錄海馬場興奮性突觸后電位(field excitatory postsynaptic potentials, fEPSPs),研究了不同的Aβ片段對(duì)大鼠海馬CA1區(qū)在體LTP的作用以及可能的α7 nAChRs機(jī)制。 方法:實(shí)驗(yàn)采用雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠,麻醉后將其固定于腦立體定位儀上,分別將腦室套管和綁定在一起的同心圓雙電極刺激電極和單極記錄電極,精確插入到側(cè)腦室或海馬的刺激與記錄部位。通過給予海馬Schaffer側(cè)枝單個(gè)電刺激、強(qiáng)直電刺激和雙脈沖刺激,在海馬CA1區(qū)放射層誘發(fā)和記錄基礎(chǔ)的fEPSPs、強(qiáng)直刺激引起的fEPSP的長時(shí)程增強(qiáng)即LTP,以及配對(duì)脈沖引起的雙脈沖易化(paired pulse facilitation, PPF)。經(jīng)腦室套管向側(cè)腦室內(nèi)注射Aβ25-35、Aβ31-35、choline、MLA觀察各種藥物對(duì)基礎(chǔ)fEPSPs、LTP以及PPF的影響。 結(jié)果:(1)Aβ25-35和Aβ31-35均不影響基礎(chǔ)性突觸傳遞,但對(duì)于高頻刺激引起的LTP具有明顯的壓抑作用。給予HFS后15 min、30 min、60 min,對(duì)照組fEPSPs幅度增強(qiáng)至161.0±4.1%, 154.2±4.0%和145.3±2.6%;25 nmol Aβ25-35預(yù)處理30min并給與HFS后,fEPSPs幅度分別只有131.5±3.0%, 129.6±3.7%和123.7±2.8%;同樣,給予25 nmol Aβ31-35后其幅度只有138.7±5.6%, 137.9±3.7%和129.0±3.8%。表明:兩種Aβ片段均可明顯壓抑海馬CA1區(qū)的LTP (P0.01)。(2)單獨(dú)給予α7 nAChRs特異性的激動(dòng)劑choline后,基礎(chǔ)性突觸傳遞和LTP都沒有發(fā)生明顯改變,但卻顯著加強(qiáng)了Aβ31-35對(duì)在體LTP的壓抑作用。Choline與Aβ31-35共同給藥組LTP值在HFS后15 min, 30 min和60 min時(shí)分別為123.3±4.0%, 117.4±4.9%和112.8±3.7%,與單獨(dú)給予Aβ31-35組比較,LTP值明顯降低(P0.05)。表明choline能夠加強(qiáng)Aβ的LTP傷害作用。(3)單獨(dú)給予α7 nAChRs特異性拮抗劑MLA后,海馬LTP被顯著抑制,但與Aβ31-35合用時(shí)卻部分保護(hù)了Aβ31-35對(duì)在體LTP的損傷作用。在單獨(dú)MLA處理組(10ug),HFS后15 min、30 min和60 min時(shí)LTP值分別降至139.8±4.2%, 134.5±2.8%和125.8±1.9%(P0.01);在MLA與Aβ31-35合用組,LTP值分別為154.2±7.6%, 152.1±5.8%和143.8±2.7%,較單獨(dú)給予Aβ31-35組明顯增高(P0.01或P0.05)。說明MLA能夠部分逆轉(zhuǎn)Aβ對(duì)LTP的傷害效應(yīng)。(4)實(shí)驗(yàn)中各組PPF都沒有顯著差異,提示所用各種藥物影響LTP主要不是通過突觸前機(jī)制實(shí)現(xiàn)的。 結(jié)論:腦室內(nèi)注射Aβ25-35和Aβ31-35能夠同等程度地壓抑大鼠海馬在體LTP,α7 nAChRs的特異性激動(dòng)劑choline能夠增強(qiáng)Aβ31-35的壓抑作用,而α7 nAChRs的特異性拮抗劑MLA卻能保護(hù)Aβ31-35對(duì)在體LTP的損傷作用。結(jié)果提示,腦內(nèi)Aβ分子的31-35序列和α7 nAChRs可能都是AD治療的潛在靶點(diǎn),α7 nAChRs可能參與了Aβ引起的在體大鼠海馬CA1區(qū)LTP的傷害作用。因此,我們推測,在AD的治療過程中,適當(dāng)下調(diào)α7 nAChRs的活動(dòng)可能有助于認(rèn)知功能的改善。 目的:本實(shí)驗(yàn)利用Morris水迷宮測定大鼠空間學(xué)習(xí)記憶功能,觀察了側(cè)腦室給予Aβ25-35、Aβ31-35、choline、MLA、以及合用choline或MLA和Aβ31-35后,大鼠在Morris水迷宮中的行為學(xué)表現(xiàn),探討了α7 nAChRs在Aβ引起的空間學(xué)習(xí)記憶功能損傷中的作用。 方法:實(shí)驗(yàn)取運(yùn)動(dòng)靈活、無視力障礙的成年雄性SD大鼠(230-250g)隨機(jī)分組,行Morris水迷宮定位航行和空間探索實(shí)驗(yàn),分別測定大鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶能力。主要指標(biāo)包括大鼠尋找水下平臺(tái)的平均逃避潛伏期和游過距離、撤離平臺(tái)后大鼠在目標(biāo)象限游過時(shí)間(限定時(shí)間為:120秒)和距離。同時(shí),測定各組大鼠的游泳速度以及大鼠的視力以排除運(yùn)動(dòng)能力與視力障礙對(duì)測定指標(biāo)的影響。各種藥物均由側(cè)腦室給予。 結(jié)果:(1)對(duì)照組大鼠學(xué)習(xí)記憶功能正常。逃避潛伏期在訓(xùn)練第1、2、3、4、5天分別為113.7±3.6 s, 44.6±3.7 s, 29.2±2.3 s, 23.1±1.3 s和18.2±0.7 s;大鼠找到平臺(tái)所游過的距離分別為2461.4±130.1 cm, 738.1±59.4 cm, 475.9±50.6 cm, 362.9±22.5 cm和270.2±14.0 cm;撤除平臺(tái)后大鼠在目標(biāo)象限所花的時(shí)間和距離分別為49.6±1.9 s和1090.5±83.4 cm。(2)側(cè)腦室注射25nmol Aβ31-35與Aβ25-35后顯著降低了大鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶能力,與對(duì)照組相比,平均潛伏期和游過距離兩個(gè)指標(biāo)在第2-5天都明顯延長,分別為35.9±1.2 s和654.2±32.8 cm(P0.01或P0.05);撤除平臺(tái)后大鼠在目標(biāo)象限游泳所占時(shí)間和距離顯著縮短,分別為37.9±1.8 s和655.9±25.5 cm(P0.01)。(3)側(cè)腦室注射α7 nAChRs激動(dòng)劑choline(100 ug)后,大鼠的學(xué)習(xí)、記憶功能均未受到影響,但聯(lián)合給予choline與Aβ31-35后,與Aβ31-35相比,平均潛伏期和游過距離兩個(gè)指標(biāo)在第3-5天都明顯延長,分別為68.2±5.9 s, 53.0±7.2 s, 39.0±2.7 s和1394.2±184.8 cm, 872.4±115.9 cm, and 595.9±39.2 cm(P0.01),撤除平臺(tái)后大鼠在目標(biāo)象限游泳所用時(shí)間和距離顯著縮短,分別為33.2±1.3 s和588.3±26.9 cm(P0.05)。(4)側(cè)腦室注射α7 nAChRs特異性的拮抗劑MLA(10 ug)后,大鼠的定位航行和空間探索能力均明顯降低(P0.01或P0.05)。但聯(lián)合給予MLA與Aβ31-35后,MLA部分逆轉(zhuǎn)了Aβ31-35所引起的學(xué)習(xí)記憶功能損傷。大鼠在定位航行實(shí)驗(yàn)中第2-5天的平均潛伏期分別為61.5±3.8 s, 32.8±2.2 s, 25.0±2.8 s和19.6±0.6 s,游過距離為1031.8±107.9 cm, 450.0±51.0 cm, 362.6±33.8 cm和253.2±17.5 cm;空間探索實(shí)驗(yàn)中大鼠在目標(biāo)象限游泳所用的時(shí)間和距離分別為52.8±1.6 s和926.4±42.8 cm。與單獨(dú)給予Aβ31-35相比,大鼠的學(xué)習(xí)、記憶功能均有顯著改善(P0.01或P0.05)。(5)各實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物在可視化平臺(tái)實(shí)驗(yàn)中的逃避潛伏期和游泳速度均沒有顯著區(qū)別。 結(jié)論:側(cè)腦室注射Aβ31-35或Aβ25-35能夠同等程度地傷害大鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶能力,該結(jié)果為我們提出的“31-35序列可能是Aβ分子的最短活性中心”假說提供了直接的行為學(xué)證據(jù)。同時(shí),α7 nAChRs激動(dòng)劑實(shí)驗(yàn)表明, choline預(yù)處理可加強(qiáng)Aβ對(duì)大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶功能的損傷作用;α7 nAChRs拮抗劑實(shí)驗(yàn)表明,腦室內(nèi)單獨(dú)給予MLA(10 ug)可降低大鼠的空間學(xué)習(xí)、記憶能力,但MLA的預(yù)處理能夠有效對(duì)抗Aβ31-35引起的大鼠空間學(xué)習(xí)記憶損傷。這一結(jié)果提示,α7 nAChRs可能參與了Aβ引起的空間學(xué)習(xí)記憶功能的傷害過程,適當(dāng)下調(diào)α7 nAChRs功能活動(dòng)可能有助于AD的治療。
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R749.16

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 祁金順,喬健天;β-淀粉樣蛋白31-35片段對(duì)海馬神經(jīng)元分離膜片Ca~(2+)激活大電導(dǎo)鉀通道的抑制[J];生理學(xué)報(bào);2001年03期

本文編號(hào)：2795872